小鼠胰岛的分离和移植

目的改进小鼠胰岛分离和移植方法。方法利用胆总管穿刺方法灌注胰腺,滤网过滤后人工挑取方法纯化胰岛;采用肾被膜下胰岛移植方法进行移植;用双硫棕(DTZ)染色方法鉴定分离纯化后的胰岛并计数;血糖仪动态检测胰岛移植后糖尿病小鼠血糖值;免疫组织化学染色观察肾脏被膜下胰岛存活情况。结果分离纯化后获得高纯度胰岛,可被DTZ染成猩红色,呈圆形或椭圆形;经计数每只小鼠可获胰岛(134±12)个;肾脏被膜下胰岛移植后血糖检测显示,移植胰岛后糖尿病小鼠可长期维持正常血糖值,移植胰岛在小鼠体内发挥了正常功能;免疫组织化学染色显示移植入的胰岛生存状态良好。结论依改进后的技术方法进行胰岛分离和移植,分离获得的胰岛纯度高、活力强,移植物功能正常、存活时间长,是一种简捷稳定的技术方法。     

胰岛移植研究进展

胰腺组织的移植,包括胰腺器官(胰腺)和胰岛细胞(胰岛)移植,已经被公认为是治疗1型糖尿病的一个临床选择。成功的胰腺或胰岛移植相对于传统的外源性胰岛素注射疗法来说,可以达到一个正常或接近正常的血糖控制水平和糖化血红蛋白水平,而且还不会出现胰岛素疗法经常出现的严重的低血糖反应。两种类型胰腺组织的移植,都可以有效的降低严重低血糖的事件发生。而且胰腺移植已经被证实可以长时间使血糖保持一种持续正常稳定的状态。对于接受胰腺移植的糖尿病患者,其优点是血糖可以很好的得到控制;但同时也面临着出现手术以及移植后并发症的风险。与胰腺移植相比,成人胰岛细胞移植更加安全,手术简捷,并发症极少,并可多次重复进行;其更加吸引人的地方是它创伤性更小。而且,通过移植前的特殊培养,未来有望实现脱离免疫抑制剂的胰岛移植。不足之一是胰岛移植往往不能使血糖控制在一个稳定的水平,这一点对降低糖尿病并发症的发生往往又是必须的。另外,胰岛移植又使接受移植的患者不得不承受免疫抑制治疗带来的一系列不良反应。尽管新近的发展已使胰岛移植后脱离胰岛素治疗的比率有了很大提高,但是如何使移植物保持更长时间的活力和功能以更好的控制血糖,今后还有很多的事情要我们去做。本文将...     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.     

成人胰岛细胞的分离纯化与应用

目的 探讨成人胰岛细胞分离纯化技术,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞.方法 使用LiberaseHI复合胶原酶和改良的Recordi自动胰岛细胞分离技术分离胰岛,采用COBE2991细胞淘洗仪连续密度梯度离心纯化胰岛细胞,用DTZ和AO-PI染色显微镜下评价胰岛细胞的数量、纯度和活性.结果 该组研究共分离30例胰腺的胰岛,获得胰岛细胞数量平均为(316626±191972)IEQ,平均每克胰腺收获胰岛细胞3389 IEQ,收获的胰岛纯度平均为(74.70±7.84)%,活度平均为(94.10±2.19)%,胰岛细胞刺激指数平均为(3.68±0.58).在此基础上,成功实施7人12次的成人胰岛细胞移植.结论 成功建立了改良的Recordi自动胰岛分离技术,获得大量高纯度有活性的胰岛细胞,为开展胰岛细胞临床移植提供了保障.     

二苯硫酰卡巴腙胰岛染色法

胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的有效方法,获得大量纯净的胰岛是移植成功的前提。因成人胰腺来源困难,故多采用胚胎胰岛。我们参阅有关文献,将胰腺组织的胶原酶消化液,用二苯硫酰卡巴腙做胰岛染色,显微镜下分离胰岛,效果良好,报告如下。1 材料和方法1.1 材料二苯硫酰卡巴腙(DTZ)、胶原酶V型、RPMI1640培养液均为Sigma公司产。人水囊     

胰岛移植

过去2、3年内,研究人员从动物身上移植分离了分泌胰岛素的郎格罕氏岛(区别于含有胰岛的胰腺组织),并取得了明显的进步。目前,几个研究小组正着手于临床试验。科罗拉多大学卫生科学中心外科教授Richard Weill Ⅲ同该处的糖尿病研究主任Kevin Lafferty合作,1984年冬天首次在人体进行了2例尸体胰岛移植。但研究人员最近说:“现在确定移植物是否起作用为时尚早。”胰岛移植可促进血糖的正常和准确的控制,故能预防糖尿病的并发症。但是,两个主要问题(获得和分离足够的胰岛以及防止日后     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞及其对坏死胰腺组织的修复

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导转化为胰岛样细胞及其对坏死胰腺组织修复的可能性。 方法：①取大鼠骨髓细胞,进行MSC培养纯化扩增,用bFGF、EGF、条件培养液、高糖培养基、B27、地塞米松、胰岛素等培养体系诱导MSC向胰岛细胞转化;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞。②结扎大鼠胰腺组织及其血管6~7 h制作胰腺局部坏死模型。将分离、纯化、诱导的MSC和骨髓细胞用DAPI标记,分别移植到实验组（移植MSC）和对照组（移植骨髓单个核细胞）。观察大鼠生存状态并于2周后取胰腺组织检测。结果：①体外扩增的MSC诱导转化后,细胞由初期的长梭形变成多角形或圆形并逐渐聚集成团。双硫腙染色大部分细胞团呈亮红色,初步表明MSC可诱导转化为胰岛样细胞。②实验组大鼠成活率达80%,坏死的胰腺组织被修复,变黑的胰腺组织基本恢复正常,胰腺组织中存在核呈兰色荧光的细胞;对照组的动物腹腔积水、粘连,2周内全部死亡。结论：大鼠骨髓MSC可在体外诱导转化为胰岛样细胞,并可修复损伤的胰腺组织。     

成人胰岛的分离及纯化

本文作者运用自动分离方法，测定了６例健康成人非正常死亡胰岛数目，为以后的胰岛细胞培养及移植奠定基础。本研究发现成人胰腺通过胶原酶适当处理后，获得的胰岛数目多，经过Ｆｉｃｏｌｌ纯化后，胰岛纯度高，且其形态，功能保持完整，这为胰岛细胞移植提供了丰富的细胞来源。     

成人胰岛的分离及纯化

本文作者运用自动分离方法，测定了６例健康成人非正常死亡胰岛数目，为以后的胰岛细胞培养及移植奠定基础。本研究发现成人胰腺通过胶原酶适当处理后，获得的胰岛数目多，经过Ｆｉｃｏｌ纯化后，胰岛纯度高，且其形态、功能保持完整，这为胰岛细胞移植提供了丰富的细胞来源。     

胰腺移植和胰岛移植的现状与发展方向

与传统的胰岛素治疗相比,胰岛细胞替代（胰腺器官移植或分离胰岛移植）是获得稳定正常血糖状态和避免低血糖发作的惟一治疗方法。临床胰岛移植可使1型糖尿病成为胰岛素不依赖,胰岛移植手术安全简便。长期研究强烈提示有效的胰岛移植可防止和延缓1型糖尿病慢性并发症进展,这些获益的代价往往需要长期应用具有潜在风险的免疫抑制治疗。近年来随着成人胰岛移植的广泛开展,对免疫抑制方案的改进,其毒副作用尤其致糖尿病作用明显减少,胰岛移植可能成为1型糖尿病较理想的治疗方法。     

胰腺移植排斥反应的监测、治疗与预防[综述]

<正> 一、胰腺移植的概况 糖尿病是一种进行性波及全身各系统的疾病,晚期则可危及生命。在西方世界,糖尿病是因疾病而致死的第五位原因,它是引起失明常见的第二位原因。自从1921年发现胰岛素以来,虽然对糖尿病患者的生存起到一定的延长作用,但它不能使该病获得彻底的治愈。因取自异种动物胰岛素的长期应用,则可产生抗体,这种抗体随着胰岛素用量的增加而增加,从而使注入的胰岛素失去其应有的生物活性,最终对病人失去效用。因此用胰腺移植来代替胰岛β细胞的功能衰竭,是根治糖尿病的最有希望和最有发展前途的措施。胰腺移植包括:全胰、胰段和胰岛细胞移植,胰段移植优于全胰移植为当今的趋势。     

小鼠胰岛细胞分离纯化后门静脉注射肝内移植模型的建立

目的建立高效。高纯度小鼠胰岛细胞分离纯化，经小鼠门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内移植方法。方法动物手术放大镜下，采用小鼠胆总管内灌注胶原酶方法消化，非连续梯度离心液离心，纯化胰岛，立体显微镜下用将胰腺外分泌组织、腺泡、淋巴结、导管组织吸走，胰岛计数后门静脉注射移植到同种异体受体小鼠肝内。结果胰岛分离时间约180min，纯化后每只小鼠可获200个胰岛。同系胰岛移植后1～2d，糖尿病小鼠血糖下降至11．1mmol／L以下。结论小鼠胰腺采用胆总管灌注胶原酶方法消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性，采用门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内可明显降低糖尿病小鼠血糖值，这一模型的建立可为今后进行人胰岛小鼠移植提供有价值的实验依据。     

胰腺与胰岛移植(综述)

胰岛素发现已60年,其对糖尿病的治疗并未失去意义,但胰岛素治疗不能防止青少年型糖尿病多年后出现肾、血管和视网膜病变。动物实验表明胰腺移植后血清胰岛素浓度正常,可防止并消除糖尿病微血管发生病变。因此近年来胰腺移植治疗青少年型糖尿病有了发展,目前有三种方法,即全胰移植,胰节段移植和胰岛移植。三种方法都是移植足够量有功能的内分泌腺,使糖代谢恢复正常,目前胰腺移植和节段胰腺移植并发症发生率高,故胰岛移植为目前的重要研究课题。     

应用淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的实验研究

目的：建立一种简便、易行和高效的胰岛分离纯化方法，以减少对胰岛细胞的损伤，获得高质量的胰岛组织。方法：选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液，分离消化胰腺组织，用淋巴细胞分离液(histopaque-1077)纯化胰岛细胞。结果：可收获大量的高纯度胰岛，纯度达95％以上，体外葡萄糖刺激实验表明胰岛对刺激反应良好，将胰岛移植于糖尿病小鼠体内可短期纠正其高血糖状态。结论：应用单一密度淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的方法是一种操作简单、价格低廉、重复性好的大鼠胰岛纯化方法。     

高纯度胰岛的分离制备

通过胆管灌流或胰腺浆膜下多点注射,使胰腺组织膨胀而清晰可见。取出胰脏,用剪剪成细小颗粒。用胶原酶及透明质酸酶消化。非胰岛组织被消化破坏,而胰腺仍保存完整。通过反复倾泻的方法,除去溶液中的杂质,然后在显微镜下手工挑选,可获得高纯度胰岛。     

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

第12至38周胚胎胰腺的组织发生

用同种异体胰腺和胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的研究已较普遍,并应用于临床取得一定疗效,但是目前尚存在某些问题影响移植后的效果。本文通过123例人胎胰腺组织发生的观察,对影响胰腺和胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的因素进行初步探讨。     

胰腺移植的改进

胰腺移植似乎明显地解决了胰岛素依赖型糖尿病的问题。但是,这种手术仅在少数人中获得成功。大多数移植的胰腺都受到排斥, 仅有九分之一以下的人能持续在一年以上。另一种方法是移植胰腺中能产生胰岛素的胰岛。这种方法在许多方面要更简单。因此,手术的危险性也少。然而,动物实验证明,移植排斥仍然是一个不可克服的问题。普通的免疫抑制剂对移植的胰腺组织不能很好地起作用。目前,美国圣路易斯的研究人员使用了一种技术,能不使用免疫抑制药物而防止胰岛移植的排斥反应。到目前为止,这种对糖尿病人     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

胰岛移植现状

<正> 随着全胰或胰片段移植的开展,一些学者又进行了胰岛移植的研究。一、胰岛的分离与提纯最初获取胰岛是用手工进行分离,这种方法费工而且效率低。Moskalewski利用胶元酶(collagenase)破坏豚鼠胰腺的纤维结构。1967年Lacy和Kostianovsky把胶元酶消化技术用于大鼠,并成功地应用蔗糖梯度离心使胰岛组织与胰的腺泡组织进一步分