修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体的构建

目的 构建人修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.方法 提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hMTHI基因cDNA保守序列，经pGEMT载体克隆后双酶切，将cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl，构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，并转染细胞。用Western-blot法检验载体抑制hMTH1蛋白表达的效率。结果 经RT-PCR获得423bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为hMTH1基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，测序后确证。该载体转染细胞后，可使hMTH1蛋白水平下降约46％。结论 成功构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.     

具有抑制肿瘤前景基因-人MCPIP基因的克隆及细胞定位

目的 构建人MCPIP基因的真核表达载体,观察其在人胚肾细胞系(HEK293T)细胞中的表达及其定位特征.方法 佛波酯(PMA)刺激单核细胞THP-1转化为巨噬细胞,提取细胞mRNA,反转录为cDNA作为模板,扩增MCPIP基因编码区序列,克隆入真核细胞载体中,酶切鉴定目的 基因.将重组质粒转染HEK293T细胞,Western blot检测MCPIP蛋白质表达状况,激光共聚焦显微镜下直接观察基因定位情况.结果 酶切鉴定和测序证明,成功构建MCPIP真核表达载体.Western blot检测表明MCPIP真核表达载体转染293T细胞表达大小约为70kD的蛋白质.激光共聚焦显微镜下直接观察RFP-MCPIP表达可见在293T细胞中主要为细胞质中点状分布.结论 本研究成功构建了MCPIP真核表达载体,检测到MCPIP在巨噬细胞中高表达.并成功证实其细胞质点状定位的特征.     

miR-33b表达载体构建及表达活性检测

目的:构建miR-33b真核表达载体及其表达活性检测。方法:人工合成miR-33b成熟cDNA序列,以GV251为载体,构建miR-33b真核表达载体,并对重组克隆进行测序确保载体构建成功;采用脂质体转染法将miR-33b表达载体导入人胃癌细胞MKN-28中,通过倒置荧光显微镜观察转染效率,再利用实时定量RT-PCR检测miR-33b的表达,以检测外源基因的表达活性。结果:成功构建了miR-33b真核表达载体;转染细胞后采用倒置荧光显微镜观察表明载体中GFP的表达活性较好;实时定量RT-PCR结果表明,相较于对照组细胞,miR-33b转染组中miR-33b表达显著增加,且具有显著性差异(P0.05)。结论:成功构建miR-33b真核表达载体,并为进一步研究miR-33b参与胃癌发生发展机制奠定基础。     

RNAi对成牙本质细胞表达TRAF6干涉作用

目的采用针对小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的siRNA真核表达载体,探讨其对小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23中表达TRAF6的干涉作用。方法将构建成功的2个针对TRAF6基因的siRNA真核表达载体(pSUPER-T和pSUPER-2T),通过脂质体介导瞬时转染MDPC-23细胞,RT-RCR和Western blot法检测其对转染后细胞中TRAF6的mRNA和蛋白表达干涉效果。结果 pSUPER-T和pSUPER-2T转染MDPC-23细胞后,RT-RCR法显示2组TRAF6 mRNA表达下调、Western blot结果表明2组TRAF6蛋白表达水平降低,其中pSUPER-2T转染组抑制TRAF6表达作用较强。结论针对TRAF6的siRNA真核表达载体,在MDPC-23细胞中有效发挥了TRAF6表达干涉作用。     

Endo G基因过表达对镉诱导HEK-293细胞凋亡影响

目的 观察细胞凋亡因子核酸内切酶G( endonuclease G,Endo G)基因过表达在镉诱导人胚胎肾细胞HEK-293凋亡中的影响.方法 从人肝癌细胞系(human hepatocarcinoma cells,HepG 2)中提取RNA,经逆转录获取互补DNA cDNA),通过聚合酶链反应(PCR)扩增Endo G基因,与pcDNA 3.0相连,构建pcDNA 3.0-Endo G真核表达载体,转染HEK-293细胞,并结合不同浓度氯化镉处理细胞;通过蛋白印迹实验(Western blot)验证基因过表达,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染法及流式细胞术(FCM)检测Endo G基因过表达对镉诱导HEK-293细胞凋亡的影响,噻唑蓝法(MTT)检测细胞存活率.结果 成功构建pcDNA 3.0-EndoG真核表达载体,Endo G基因扩增片段大小约1 100 bp;该载体转染细胞后,Endo G成功过表达,使HEK-293细胞凋亡率＞37％,且随氯化镉浓度增加,Endo G表达量先上升后下降.结论 Endo G以诱导细胞早期凋亡和晚期凋亡为主要形式.     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

Livin靶向RNA干扰对人胃癌细胞SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin靶向RNA干扰对SGC7901细胞株生物学特性的影响,探索胃癌基因治疗的新途径。方法设计和构建Livin特异性的siRNA真核表达载体,转染SGC7901细胞,应用RT-PCR分析LivinmRNA的表达情况,采用MTT法检测细胞的生长状况,通过流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。结果构建真核表达载体p-siRNA1并转染SGC7901细胞后,RT-PCR结果显示2条Livin siRNA真核表达质粒均能有效抑制Livin mRNA的转录表达,干扰组细胞与未转染组细胞比较,生长受到明显抑制,凋亡率明显增加。结论成功构建了Livin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人胃癌细胞Livin mRNA表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。     

人tankyrase 1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的 探讨反义tankyrase 1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响.方法 构建人tankyrase 1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,从光镜、电镜水平观察转染与未转染细胞形态学的变化.结果 与亲本细胞相比,光镜下反义tankyrase 1基因转染的SGC-7901...     

转录因子T-bet在鼻黏膜上皮细胞中的表达及对儿童变应性鼻炎的应用前景

目的:构建重组人T细胞转录因子T-bet穿梭载体,研究其在人鼻黏膜上皮细胞(Nasal Mucosa EpithelialCell,NMEC)中的表达,探讨其在儿童变应性鼻炎治疗中的意义。方法:采用RT-PCR方法从健康人PBMC总RNA中扩增出转录因子T-bet的cDNA序列,从而构建成重组穿梭载体pDC316T-bet;采用阳离子脂质体介导将重组穿梭载体pDC316T-bet转染至体外培养的人NMEC。RT-PCR半定量检测T-bet mRNA含量。结果:成功构建重组人T-bet穿梭载体pDC316T-bet。mRNA水平检测,T-bet在转染的人NMEC有稳定的表达。结论:重组穿梭载体pDC316T-bet可转染T-bet基因在体外培养的人NMEC内稳定表达。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

人白细胞介素10基因克隆及真核表达

目的建立人白细胞介素-10(hIL-10)真核表达系统并观察其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达。方法用RT—PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10cDNA，将其克隆至pMD18-T中，测序正确后，再定向插入至真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染CHO细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌并进行活性检测。结果RT—PCR扩增的hIL-10cDNA序列与GenBank中hIL-10cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneO—hIL-10；转染CHO细胞后可检测到具生物活性的hIL-10的转录和表达。结论成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物生产打下基础。     

一株新蛋白磷酸酶基因（Sy2）的原核表达载体构建及鉴定

目的用含有人Sy2酪氨酸磷酸酶基因的pOTB7质粒,构建Sy2原核表达重组子,并用该重组子转化原核细胞,表达出含Sy2的融合蛋白,为将来以此融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体,进一步研究该基因的功能打好基础。方法用PCR扩增Sy2的PP2C结构域序列,限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pET28a( )中,酶切、测序等鉴定后,重组子pET28a( )-Sy2转染原核细胞,用载体标签His抗体经SDS-PAGE、Western blot方法检测Sy2重组蛋白的表达。结果成功构建出pET28a( )-Sy2重组质粒,Western blot方法检测出融合蛋白的表达。结论成功构建原核表达载体并在原核细胞中表达成包涵体,这种包涵体可以作为抗原制备Sy2的单克隆抗体。     

重组CKB真核表达载体的构建及其稳定转染NCI—H520细胞系的建立

目的构建pEGFP—N1－CKB真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞NCI—H520中,建立稳定转染的NCI—H520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以人CKBcDNA文库为模板,用PCR扩增人CKBcDNA的编码区,并将扩增的cDNA片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系NCI—H520,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用Westernblot检测转染前后该细胞株CKB基因的表达。结果pEGFP—N1－CKB经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经Westernblot检测,重组质粒转染株中CKB基因的表达水平明显高于对照组,证实CKB基因已稳定转染到NCI-H520细胞中并得到表达。结论成功构建了pEGFP—N1－CKB真核表达质粒,建立了稳定表达CKB的NCI-H520细胞系,为进一步研究CKB的生物学功能奠定了基础。     

神经突起因子酵母双杂交诱饵质粒构建和转化

目的构建和转化神经突起因子（Neuritin）的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究Neuritin的功能及作用机制奠定基础。方法用PCR扩增neuritin全长eDNA中编码开放读框的基因片段；将该基因片段与pLexA载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op—LaeZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA-neufitin重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的2种EGY48[p8op—LaeZ]酵母都能在SD／Gal／Raf／-His／-Ura培养基中长成白色菌落，同时，转化pLexA-pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落，但都不能在SD／-His／-Leu／-Ura培养基中生长，在SD／-His／-Ura液中培养16h后，A600均值均为0．9。表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和laeZ酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及原核表达

目的 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒，进行原核表达。方法 以Hela细胞的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-B-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1，以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组蛋白进行分析。结果经核苷酸序列测序和sDS—PAGE法鉴定，成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌，并表达和纯化了sTNFR-MBP融合蛋白。结论成功地构建了人sTNFR1重组质粒克隆，表达并纯化了sTNFR1-MBP融合蛋白。     

pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性研究

目的建立TPA基因在人脐静脉内皮细胞外源性表达的方法，为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和新方法。方法构建真核表达载体pcDNA3．1( )TPA，并采用脂质体法将其转入体外培养的人脐静脉内皮细胞，并现察外源性TPA表达情况。结果真核表达载体pcDNA3．1( )TPA在人脐静脉内皮细胞中获有效表达，酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为568．6ng／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为17．8ng/10^6细胞／24h；发色底物法测得外源性TPA活性为108．8IU／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为5．6IU／10^6细胞／24h。结论pcD．NA3．1( )TPA转入人脐静脉内皮细胞后，外源性TPA基因荻有效表达，为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和新方法。     

人畸胎瘤衍化生长因子原核表达载体的构建及表达

目的:构建人畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)原核表达载体,进一步探讨其生物学作用及机制。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,利用TDGF-1特异性引物通过RT-PCR方法扩增TDGF-1 cDNA,克隆入pHB载体中,构建重组载体pHB-TDGF-1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并通过SDS-PAGE及免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达TDGF-1。结论:该研究成功构建了人TDGF-1原核表达载体,并能够在大肠杆菌中有效表达TDGF-1,为进一步研究TDGF-1的生物学功能及其机制奠定了基础。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

转基因细胞系CHL-3A4的建立及其代谢活化作用

目的建立ＣＨＬ３Ａ４细胞系为某些遗传毒性化合物的代谢途径研究提供模型细胞系，并用于新合成化学物质的致突变性检测。方法应用ＲＴＰＣＲ和ＤＮＡ重组技术从人肝组织中克隆细胞色素Ｐ４５０３Ａ４基因的ｃＤＮＡ至ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３载体上，经限制性内切酶图谱分析和克隆片段部分序列测定，证实为ＣＹＰ３Ａ４ｃＤＮＡ。然后构建真核细胞重组表达质粒ｐＲＥＰ９３Ａ４，导入中国仓鼠ＣＨＬ细胞。结果建立了ＣＨＬ３Ａ４转基因细胞系，双核细胞微核试验证明该细胞系能代谢活化黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１）、杂色霉菌毒素（ＳＴＣ）、环磷酰胺（ＣＰＡ）。结论所建ＣＨＬ３Ａ４细胞系确实能表达人细胞色素Ｐ４５０３Ａ４，并能代谢活化ＡＦＢ１、ＳＴＣ、ＣＰＡ。