RNA干扰技术建立人PARP-1缺陷细胞株

目的建立并鉴定聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)缺陷细胞株,用于研究hPARP1基因的作用机制及其缺陷与DNA损伤发生的关系。方法将用已经构建的pEGFPC1shRNA(包含两个PARP1基因及一个阴性对照)转染支气管上皮细胞(16HBE),使之在16HBE中表达,转染后命名为16HBEP1、16HBEP2及16HBEN。用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP1基因的表达水平。结果pEGFPC1shRNA在真核细胞成功表达;16HBEP1和16HBEP2的蛋白表达水平分别下降了84.3%及63.7%。结论hPARP1缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hPARP1基因功能研究提供了一种有效手段。     

人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析

目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNApolymerasebeta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFPC1pU6dsRNA”,为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备。方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNAoligonucleotidedesigner设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之。通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIRENRetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coliDH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒。运用EcoRⅠ和BglⅡ消化并回收“pU6dsRNA”目的片段,再将“pU6dsRNA”亚克隆到pEGFPC1上,获“pEGFPC1pU6dsRNA”重组子,并进行酶切鉴定和序列分析。结果经酶切鉴定发现,“pEGFPC1pU6dsRNA”载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符。结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFPC1pU6dsRNA”,为进一步研究Polβ基因功能作好了准备。     

pGenesil-1-Atg7-shRNA真核表达载体的构建

目的利用RNA干扰技术,构建pGenesil-1质粒载体介导靶向自噬基因Atg7的shRNA真核表达载体。方法根据GenBank中Atg7基因的cDNA序列(NM-001136031),设计有小发卡结构的三条寡核苷酸序列,连接到空载体pGenesil-1中,转化到JM109菌株,选取阳性克隆,进行酶切鉴定和DNA测序分析。结果经双酶切结果显示合成的shRNA序列成功连接到pGenesil-1质粒载体中,DNA测序结果证实干扰序列和目的序列相同,重组载体pGenesil-1-Atg7-shRNA构建成功。结论成功构建干扰人Atg7基因的重组表达载体,为研究Atg7蛋白的生物学功能提供了研究基础。     

大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因RNA干扰表达质粒构建与鉴定

目的 构建并筛选大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)基因的RNA干扰(RNAi)表达质粒,为职业性疾患的基因治疗探索新途径.方法 根据基因序列数据库中报道的PARP-1基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1 RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectamine TM2000介导转染大鼠骨髓间充质干细胞.48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染细胞中PARP-1 mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1 RNAi质粒.结果 4种重组PARP-1 RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确.转染后48 h,转染质粒shRNA-PARP-1-532的细胞PARP-1基因抑制效果最明显,mRNA的转录水平下降了78％,可作为后续实验的有效质粒.结论 成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为探索PARP-1基因在疾病中的作用奠定了基础.     

转录因子STAT1两个亚型STAT1α和STAT1β高表达载体的构建及鉴定

目的：利用高表达载体pLJM1‐EGFP构建并鉴定转录因子STAT1基因的2个亚型STAT1α和STAT1β的过表达重组质粒（简称为pLJM1‐STAT1α和pLJM1‐STAT1β）。方法以大鼠肝脏cDNA 为模板,PCR获取目的片段（即STAT1α和STAT1β）;用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切pLJM1‐EGFP表达载体和PCR扩增的STAT1α和STAT1β基因片段后,用T4 DNA连接酶连接酶切纯化后的载体及目的基因片段;将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞、挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切和DNA测序鉴定构建的重组质粒。结果 PCR和双酶切证实pLJM1‐STAT1α和pLJM1‐STAT1β重组载体中分别成功插入了STAT1α和STAT1β基因片段。DNA测序结果表明插入的STAT1α和STAT1β基因片段的序列完全正确。结论成功构建了pLJM1‐STAT1α和pLJM1‐STAT1β高表达重组载体。     

人防御素-5基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

[目的]构建人防御素5(HD-5)基因的毕赤酵母表达载体并加以鉴定。[方法]采用PCR技术从人cDNA文库中扩增HD-5基因片段,将HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后连接构成重组质粒,然后转化到E.coliTop10中,筛选阳性克隆,并进行PCR、酶切和序列鉴定。[结果]重组质粒经酶切获得HD-5基因片段大小正确,经序列测定证实HD-5基因正确插入pPICZαA中。[结论]成功构建人防御素5基因的毕赤酵母表达载体。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中．通过RT—PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3．1^（＋）或pcDNA3．1^（-）真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363 bp相符;重组pGEM—T被EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3．1^（＋）和pcDNA3．1^（-）测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

转录因子Smad2高表达载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定大鼠转录因子Smad2的高表达载体(简称pLJM1-Smad2)。方法首先以E3大鼠肝脏cDNA为模板、PCR法获取转录因子Smad2 mRNA CDS区(即目的基因片段);然后用Age I、EcoR I双酶切pLJM1-MGFP载体和目的基因片段,用T4DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;之后再将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,扩大培养并提取重组质粒;最后用PCR、Age I和EcoR I双酶切以及DNA测序鉴定重组质粒。结果 PCR、Age I和EcoR I双酶切结果均提示pLJM1-Smad2重组载体中插入了目的片段Smad2;将含有目的片段的阳性重组体克隆送上海生工进行DNA测序,并将测序结果与NCBI数据库的进行比对,确定插入片段无突变、序列完全正确,证实pLJM1-Smad2重组载体中成功插入了目的基因片段Smad2。结论成功构建了转录因子Smad2的高表达载体pLJM1-Smad2。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体的构建

目的 构建人修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.方法 提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hMTHI基因cDNA保守序列，经pGEMT载体克隆后双酶切，将cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl，构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，并转染细胞。用Western-blot法检验载体抑制hMTH1蛋白表达的效率。结果 经RT-PCR获得423bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为hMTH1基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，测序后确证。该载体转染细胞后，可使hMTH1蛋白水平下降约46％。结论 成功构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.     

Smad3-siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建Smad3特异的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Smad3表达在肝纤维化治疗中的意义奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的Smad3基因核苷酸序列,选择设计能转录小发夹结构RNA(small hairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencer3.1-H1-hygro质粒载体连接,构建真核表达载体,使用限制性内切酶鉴定及测序鉴定是否为阳性克隆。结果成功构建pSilencer3.1-Smad3载体,拟进一步采用RNAi技术观察其对Smad3基因表达的抑制情况,从而研究其在肝纤维化治疗中的作用。结论 Smad3-siRNA真核表达载体被成功构建。     

Smad4-siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建Smad4特异的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Smad4表达在肝纤维化治疗中的意义奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的Smad4基因核苷酸序列,选择设计能转录小发夹结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与psilencer3.1-H1-hygro质粒载体连接,构建真核表达载体,使用限制性内切酶鉴定及测序鉴定是否为阳性克隆。结果成功构建psilencer3.1-Smad4载体,拟进一步采用RNAi技术观察其对Smad4基因表达的抑制情况,从而研究其在肝纤维化治疗中的作用。结论Smad4-siRNA真核表达载体被成功构建。     

ShRNA抑制gankyrin基因在肝癌细胞中表达的研究

目的 构建靶向癌基因gankyrin的短发夹状RNA （shRNA），观察其在肝癌细胞株HepG2中对gankyrin基因表达的抵制作用。方法 设计、合成三对针对gankyrin的shRNA序列，连接到带有人U6启动子的载体质粒pGenesil-1中，构建重组质粒pGenesil-1-Gandyrinl、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3，稳定转染HepG2细胞，采用RT-PCR及Western blot检测对gandyrin表达的抵制效果。结果 酶切分析和测序证实pGenesil-1-Gankyrinl、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3构建成功；其中pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3对gankyrin的表达有明显的抵制作用。结论 构建的pGenesil-1-Gankyrin重组质粒能有效抵制gankyrin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达。     

NOB1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:构建针对NOB1基因的shRNA慢病毒载体,并在卵巢癌SKOV3细胞上鉴定其沉默效率,观察其对细胞增殖能力的影响。方法:将筛选的NOB1基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与pLVTHM慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3细胞;采用Real-timePCR和Westernblot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率,MTT和克隆形成实验观察NOB1基因沉默对SKOV3细胞增殖的作用。结果:构建的shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3细胞后,NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降73.5%,蛋白表达显著抑制,同时MTT实验显示细胞增殖能力显著降低,克隆形成实验表明细胞克隆形成能力明显减弱。结论:成功构建的NOB1基因shRNA慢病毒表达载体能够在卵巢癌SKOV3细胞上有效沉默靶基因,验证了NOB1基因具有影响卵巢癌细胞恶性增殖的能力。     

质粒介导的RNAi对神经母细胞瘤细胞Survivin基因表达的抑制作用

目的构建Survivin的短发夹RNA表达质粒并通过由其介导的RNA干扰来下调神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y细胞中Survivin的表达。方法针对人Survivin的mRNA序列设计合成两对寡核苷酸序列，退火后将其连入pBSHH1．对重组质粒pBSHH1—S1和pBSHH1-S2进行酶切和测序鉴定，然后将质粒转染SH-SY5Y细胞，运用RT—PCR和Western印迹检测Survivin基因的表达。结果酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pBSHH1，pBSHH1-S1和pBSHH1—S2转染SH—SYSY细胞后，Survivin基因的mRNA以及蛋白水平的表达量均受到明显抑制结论成功构建了人Survivin基因的短发夹RNA表达质粒，并在SH—SYSY细胞中验证了它们对Survivin基因的表达抑制作用，为神经母细胞瘤等肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

人神经病靶标酯酶RNAi表达载体的构建及其对哺乳动物细胞中NTE表达的抑制

目的构建人神经病靶标酯酶（NTE）双链RNA的稳定表达载体。方法用SpeI和XhoI将pSUPER质粒中的H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子及多克隆位点部分切下替换pcDNA3．1（＋）载体中的巨嗜细胞病毒（CMV）启动子及其多克隆位点，构建了适合在哺乳动物细胞中表达具有干涉作用的小RNA的载体pSUPER／neo，进而将针对NTE表达的双链DNA插入到Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切的载体pSUPER／neo中构建NTE的双链RNA表达载体pSUPER/neo-NTE，后者被转染到COS7和SH-SYSY细胞中，采用蛋白质杂交和酶活力测定的方法，检测其表达效率并验证载体构建的TF确性。结果构建了适合在真核细胞用抗生素筛选的NTE双链RNA表达载体pSUPER／neo-NTE。蛋白质杂交检测显示，转染细胞能有效抑制外源性NTE的表达；酶活力测定则显示其能有效地抑制内源性NTE的表达．结论采用启动子替换的策略，成功构建了NTE双链RNA的表达载体并在哺乳动物细胞内有效抑制NTE的表达。