天麻总DNA提取的研究

目的：寻找快速便捷的天麻总DNA的提取方法.方法：采用天麻干品为材料,用CTAB,SDS 2种提取法及液氮、玻璃砂2种研磨方法提取干天麻总DNA,并进行了比较.结果：2种不同的研磨法和2种不同的提取方法,均可从天麻中提取到一定纯度的DNA,其中CTAB法提取的DNA纯度较好,产率较高;SDS法提取的DNA纯度较低且不稳定,产率较低.结论：从天麻干品中采用CTAB法提取DNA用于分子生物学研究是可行的,用玻璃砂研磨能取得与液氮相近的结果.     

一种适于AFLP分析的天麻花葶DNA提取方法

目的：获得能用于中药天麻扩增片段长度多态性（AFLP）分析及其它分子生物学研究的高质量DNA。方法：以天麻花葶为材料，采用改良SDS法提取天麻DNA，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。结果：改良的SDS法能获得高质量的DNA，OD260／OD280为1．75～1．9，蛋白质、多糖、RNA等去除较彻底，适于AFLP分析。结论：改良的SDS法所提取天麻DNA适于AFLP分析。     

连翘干燥叶片高质量DNA的提取方法研究

目的：探讨不同DNA提取方法对连翘干燥叶片的DNA质量及RAPD—PCR标记结果的影响，找出提取连翘总DNA的最佳方法。方法：分别用常规CTAB法、高盐低pH法和改良CTAB法提取连翘总DNA．分别进行琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收A260／A280和RAPD—PCR分析，通过比较找出提取连翘总DNA的最佳方法。结果：以CTAB法为基础的改良CTAB法可获得较高质量的DNA进行PCR扩增。结论：改良CTAB法是一种分离高质量完整DNA的简便、快速方法。     

白木通基因组DNA提取方法研究

以白木通新鲜叶片为材料,采用改良CTAB法提取DNA,并对提取的DNA进行了纯度鉴定和PCR检测。结果表明：改良的CTAB提取法,能够有效去除次生物质对DNA的干扰,提高提取DNA的质量和纯度,适宜白木通叶片DNA的提取。该改良法提取的DNA可用于SRAP分析。     

天麻微卫星DNA分子标记与天麻素含量的关系

目的：探讨天麻遗传变异与其品质的关系,为优良种质的选育提供科学途径。方法：采用CTAB法提取天麻DNA,进行PCR扩增,用微卫星DNA分子技术（SSR）标记DNA;用高效液相色谱法检测不同种质天麻的天麻素含量,分析两者之间的关系。结果：出现A条带类型的样品天麻素含量较高,7EKYC、9EDF;24GBJ、22GZJ;1FDJ、2FLL;4VDF、6EKYW;18GWAC、8EWD,分别聚到一起,遗传距离较小。结论：特异引物扩增位点与天麻素含量有关,高天麻素含量与SSR高分子量条带有关,其关系有待进一步研究。     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的：优化提取基因组的方法,建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法,用于大批量转基因小鼠鉴定。方法：用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果：经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量,显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别;酶切全基因组后,2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开;两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论：一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠,可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

天麻DNA的快速提取方法

目的建立天麻基因组DNA快速提取方法.方法CTAB 酚/氯仿法加以改良提取DNA.结果本方法提取的DNA纯度高(A260/A280》1.8),耗时短(2～3h),分子大小约为50kb,适用于随机扩增多态性DNA(RAPD)分析.结论本方法提取DNA纯度高,耗时短,成本低,提取的DNA适宜RAPD分析.     

基因释放剂在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板中的应用

目的：探讨基因释放剂的应用并为结核病DNA疫苗的研究提供靶基因。方法：分别用基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板，采用PCR法从模板中扩增早期分泌性抗原靶(ESAT-6)基因并测序证实所扩增的基因是否为目的基因。结果：从基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备的DNA模板中均成功地扩增出了目的基因ESAT-6。结论：基因释放剂提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板方便、快捷，提高了制备DNA模板效率。     

石蜡包埋表皮组织中β-连环蛋白基因扩增技术的建立

目的：建立从石蜡包埋表皮组织中提取DNA，进行β-连环蛋白基因3号外显子聚合酶链反应(PCR)扩增的方法。方法：从14例不同重量、不同年代石蜡包埋皮肤鲍温氏病病变组织中提取DNA，再进行β-连环蛋白基因3号外显子PCR扩增。结果：5mg组织提取DNA的PCR扩增未获成功，而用10mg和20mg组织提取的DNA可成功扩增；已包埋10年以上的5例标本仅2例成功扩增，而9例10年以内的标本全部成功。结论：10mg及10mg以上且10年以内的石蜡包埋表皮组织可用于目标基因PCR扩增。     

药用植物珠子参新鲜块根DNA提取方法研究

目的为获取珠子参高质量、高产量的总DNA,满足SSR-PCR标记实验。方法采用经典CTAB法、改良CTAB法、高盐低PH法和SDS法对珠子参总DNA提取方法进行比较研究,用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。结果 4种方法中产量最高的为经典CTAB法,产率为149.533ng/g,纯度最高的为改良CTAB法,OD260/OD280为1.796。结论 4种方法提取的DNA质量均满足SSR-PCR标记实验,扩增效果改良CTAB法和SDS法效果最佳。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

贵州天麻野生与栽培品种的简单序列重复标记鉴定

目的:利用简单序列重复(SSR)分子标记鉴定贵州天麻4个居群的野生和栽培品种.方法:合成8对SSR引物用于天麻基因组DNA的PCR扩增.结果:除引物对16外均能很好地区分野生天麻、无性繁殖天麻及有性繁殖天麻,其中有性繁殖天麻均扩增出2条带,为杂合子;野生天麻及无性繁殖天麻只扩增出1条带,为纯合子.结论:天麻的自交及杂交是形成纯合与杂合的原因.SSR分子标记可有效地区分纯合子及杂合子,从而使其能够在分子水平鉴定野生和栽培天麻.     

高效液相色谱法测定天麻中L-焦谷氨酸的含量

应用ＨＰＬＣ法对没来源和加工方法不同的天麻Ｇａｓｔｒｏｄｉａ ｅｌａｔａ Ｂｌ,中Ｌ－焦谷氨酸成分进行了定量分析。结果显示Ｌ－焦谷氨酸在天麻中的含量因产地、栽培方法和加工方法的不同而有差异。野生比家种、鲜品比干品的Ｌ－焦谷氨酸含量高。     

利用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯的研究

目的研究野生天麻总DNA对马铃薯的转化,分析马铃薯转化植株中野生天麻的药用成分天麻素。方法采用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯试管苗,通过紫外扫描法、PCR扩增筛选转化植株,对转化植株进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)蛋白分析,通过TLC法检测天麻素。结果(1)在200株转化的马铃薯中有21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异,且在220 nm有明显吸收峰。(2)5株经PCR扩增出野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因。(3)转基因马铃薯与正常马铃薯的蛋白表达有明显差异,并且在转基因马铃薯中有一条与GAFP相同的条带。而正常马铃薯中无此条带。(4)通过薄层色谱法检测出3株转基因马铃薯表达野生天麻的有效药用成分天麻素。结论采用浸苗法进行外源总DNA导入是可行的。     

6种成药中原料药材金银花的分子鉴别研究

目的：研究位点特异性PCR方法在中成药鉴定方面的应用。方法：本实验选用6种含有金银花原料药材的中成药为研究对象,采用改良CTAB法提取其总DNA,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化;通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）对trnL-trnF叶绿体序列进行扩增,将扩增产物进行不同浓度稀释;以稀释后样品作为模板,分别选择金银花特异性鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后,进行Blast N比对分析。结果：连翘败毒丸、梔子金花丸、牛黄清宫丸、金噪散结丸、健脑补肾丸、金噪开音丸6种中成药中均含有原料药材金银花。结论：采用位点特异PCR方法鉴定中成药中原料药材具有一定的可行性。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

高质量植物基因组DNA的分离

为了从富含多酚和多糖的药用植物组织中分离出高质量基因组DNA ,本文通过改良几种已经存在的分离方法 ,获得了一种以CTAB法为基础的分离高质量完整DNA的简便、快速方法。使用该方法从人参、西洋参及三七的新鲜或干燥根组织分离DNA时 ,A2 60 /A2 80 为 1.8左右 ,分子量大小约为 2 1.2kb ,由此所得的DNA可直接用于AFLP分析 ,即用EcoRⅠ /MseⅠ消化DNA后 ,用DNA的限制酶切片段经T4DNA连接酶连接 ,再用巢式PCR扩增 ,构建出可重复的、多态性丰富的人参、西洋参、三七基因组DNAAFLP指纹图谱。结果表明 ,该技术可有效地从富含多酚和多糖的药用植物组织中分离出高质量和高分子量DNA ,此法亦有望用于其它植物DNA的分离。     

高质量植物基因组DNA的分离

为了从富含多酚和我糖的药用植物组织中分离出高质量基因组DNA,本文通过改良几种已经存在的分离方法,获得了一种以CTAB法为基础的分离高质量完整DNA的简便、快速方法。使用该方法从人参、西洋参及三七的新鲜或干燥根组织分离DNA时,A260/A280为1.8左右,分子量大小约为21.2kb,由此所得的DNA可直接用于AFLP分析,即用EcoR I/Mse I消化DNA后,用DNA的限制酶切片段经T4 DNA连接酶连接,再用巢式PCR扩增,构建出可重复的、多态性丰富的人参、西洋参、三七基因组DNA AFLP指纹图谱。结果表明,该技术可有效地从富含多酚和多糖的药用植物组织中分离出高质量和高分子量DNA,此法亦有望用于其它植物DNA的分离。     

Frequency of mitochondrial 12S rRNA gene A1555G and 961 insC mutations among children with sensorineural deafness in China

Objective： To investigate the frequency of mitochondrial 12S rRNA gene A1555G and 961 insC mutations among Chinese with sensorineural deafness. Methods： Blood samples from 78 sporadic cases with sensorineural deafness were obtained and DNA was extracted from the leukocytes, then the mitochondrial DNA target fragments were amplified by polymerase chain reaction（PCR）. The 1555G mutations were detected by BsmA 1 restriction endonuclease digestion, every fragment was analyzed by sequencing; All the 961 insC mutation were detected by direct sequencing. Results： The percent age of A1555G mutation and mt961C insertion were 6.4% and 2.6% in the hearing-impaired Chinese subjects respectively. Conclusion： A1555G and 961insC mutations in mitochondrial DNA 12S rRNA gene regions may play a role in the pathogenesis of hearing loss in the sporadic cases.