耐钙心肌细胞的分离及其L型钙通道电流观察

目的：建立大鼠心肌细胞分离方法，用于膜片钳实验，并记录L型钙通道电流，方法：基于Langendorff逆行主动脉灌流模型，以经改进的心肌细胞分离技术获得单个耐钙心肌细胞，用膜片钳全细胞方式记录L型钙电流。结果：在灌流所得50％存活单个心肌细胞中约70％为耐钙心肌细胞，并记录到典型的L型钙电流，结论：这种心肌细胞分离技术能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞，可用于心肌细胞离子通道和信号转导机制的研究。     

大鼠心室肌细胞的分离及其钙电流的观察

目的：探讨大鼠心肌细胞酶急性分离的方法，并观察大鼠心室肌细胞膜钙电流。方法：采用Lngendorff灌流装置，用含胶原酶P(0．12g/L)的台式液，经主动脉逆行灌流心脏，分离心肌细胞；采用膜片钳全细胞记录的方法，观察记录大鼠心室肌细胞膜L型钙电流。结果：心肌细胞的存活率约70％-80％，形态呈长杆状，横纹清晰，膜良好。膜片钳全细胞记录出电压依赖性内向电流，其激活电位-30mV，最大激活电位0mV，反转电位50mV，并且此内向电流可被钙通道阻滞剂维拉帕米抑制。结论：用此法可分离出高存活率的心肌细胞，并具有正常的电生理特性。     

心肌细胞分离方法的改进及其钾电流的观察

目的:探索建立简单可靠的心肌细胞的酶解分离方法,提高细胞存活率和膜片钳实验成功率.方法:采用Langendorff装置,无钙液和胶原酶P二步灌流法分离心肌细胞.显微镜下观察细胞形态结构,并应用膜片钳全细胞技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流.结果:心肌细胞存活率高,形态结构良好,可成功记录出瞬时外向钾电流.结论:通过改进的分离方法获得的心肌细胞存活率高,具有正常的电生理特性.     

大鼠肥厚心肌细胞分离方法的探讨

目的探讨适用于膜片钳实验急性分离肥厚耐钙SD大鼠心室肌细胞的方法。方法利用自制Lan-gendorff灌流装置,采用四步法获得单个耐钙心肌细胞,以适用于膜片钳离子电流的记录。结果稳定获得30%~40%肥厚耐钙心肌细胞。结论按照本方法在心肌细胞分离过程中的介绍,能获得30%~40%肥厚耐钙心肌细胞。     

膜片钳研究中的钙耐受大鼠心肌细胞分离方法

目的：探讨膜片钳实验中大鼠心肌细胞分离过程中影响细胞活性和钙耐受性的各种影响因素。方法：采用Langendorff灌流，先用台氏液灌流30s，再用无钙台氏液灌流5-7min，其后换含胶原酶Ⅰ0.1-0.2g/L的低钙本科液消化约8-30min，最后用无钙台氏液冲洗心脏2min，剪下心肌组织，KB液中37℃剪碎吹打温育5min后，用200μm筛网过滤，室温静置换液后进行膜片钳实验。结果：注意控制水，酶，温度等各种因素后，可得到杆状、横纹清晰、膜良好的耐钙心肌细胞。结论：大鼠心肌细胞分离过程中各种因素控制好后可以保证一定的细胞成活率及其质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

膜片钳技术研究中钙耐受的心室肌细胞分离方法

目的：探索并建立适合于膜片技术研究的心室肌细胞急性酶分离方法。方法：采用改进的自制的Langendorff心脏灌流系统,用无钙Tyrode液和酶解液逆行主动脉灌流之后,分次剪取心肌组织置于细胞保存液（KB液）中保存以供全细胞膜片钳方式记录膜电位和膜电流。结果：分离所得80%-90%的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的动作电位。结论：控制好分离心室肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心室肌细胞的重要因素。     

大鼠心肌细胞急性分离方法

目的 探讨酶法分离大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素，提高细胞成活率和膜片钳实验成功率。方法 采用Langendorff灌流，先用无钙液灌流7-8min，再用含胶原酶P0.1-0.3g/L的酶液灌流8-10min，剪下心室肌组织，KB液中用吸管吹打分散，过150μm筛网，放置6-7h后进行膜片钳实验。结果 在分离细胞过程中，注意控制水、酶、温度、pH、O2等各种影响因素，可得到横纹清晰、膜良好、长杆状的心肌细胞。结论 仔细调整和控制细胞分离过程中的影响因素可以保证心肌细胞成活的数量和质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

恒流灌注分离心肌细胞及膜片钳记录钾电流方法学探讨

目的探讨膜片钳实验中豚鼠、大鼠心肌细胞急性分离过程中的观察指标和影响因素,并进行膜片钳记录。方法使用改进的Langendorff恒流灌注法分离心肌细胞和全细胞膜片钳记录钾通道电流。结果分离即刻,存活细胞可达80%以上,复钙后约40%~50%呈静息状态,余出现自发性收缩,存活细胞能够进行膜片钳封接,于室温KB液中可成活8 h以上。结论使用恒流灌注法,观测灌注压的变化,可以较客观的掌握酶解消化的程度,利于获取生理状态良好的心肌细胞。且细胞能够进行膜片钳实验。     

胞外不同钠浓度对培养新生小鼠心肌细胞钠电流的影响

目的：探讨细胞外液不同的钠浓度对培养新生小鼠心肌细胞Na＋电流的影响。方法：采用膜片钳技术,在浴液不同的钠离子浓度下,记录培养新生小鼠的心肌细胞钠电流的激活、失活以及恢复曲线。结果：相对于低钠浴液,高钠浴液记录的培养新生小鼠心肌细胞钠电流明显延迟,电流幅度增加也不明显,激活曲线不圆滑。结论：胞外高钠不是记录钠电流最合适的实验方案。     

多用途成年大鼠心室肌细胞分离方法

目的 建立稳定的可同时用于细胞培养和膜片钳实验的成年大鼠心室肌细胞的分离方法 .方法 应用Langendorff灌流.生物酶消化法分离耐钙心肌细胞.分别用左右心室肌做细胞培养和全细胞膜片钳研究.结果 左室心肌细胞数(3.7±0.6)× 10~6,杆状细胞得率(84.85±2.7)%.右室心肌细胞横纹清晰,折光率好,膜片钳实验时容易封接破膜,记录到典型的I_(Ca).L、I_(K1)、I_(to)、I_(Na)电流.结论 该方法 简单、节约、重复性好,改善了杆状细胞得率、细胞质量,左右心室肌细胞分别能很好地用于细胞培养和膜片钳实验.     

单个胃肠道平滑肌细胞的分离及其细胞膜离子通道检测

目的:建立胃肠道平滑肌细胞的分离及离子通道检测方法,为胃肠道动力性疾病和离子通道相关性疾病的研究提供技术平台。方法:酶消化法急性分离胃肠道平滑肌细胞,运用离子通道膜片钳技术在全细胞模式下检测单个平滑肌细胞膜上离子通道的状况。结果:用酶消化法急性分离可获得细胞膜完整生物活性状态良好的单个胃肠道平滑肌细胞,该细胞符合膜片钳实验的要求;运用离子通道膜片钳技术在全细胞模式下可以记录基础状态和干预后单个胃肠道平滑肌细胞细胞膜上离子通道的开放状况,可用于相关的病理、生理、药理研究。结论:酶消化急性分离法是获得单个胃肠道平滑肌细胞的一种简单、有效、易操作的方法,运用该方法结合离子通道膜片钳技术可以准确记录胃肠道平滑肌细胞细胞膜上离子通道的开放状况。     

应用红外可视脑片膜片钳技术研究大鼠海马CA1神经元的电生理特性

目的:建立红外可视脑片膜片钳技术,初步观察大鼠海马CA1细胞的电生理特性. 方法:应用红外微分干涉相差技术,结合脑片膜片钳记录,对健康SD大鼠海马CA1细胞电生理特性进行观察,并分析影响记录成功的主要因素. 结果:红外可视膜片钳技术可实时观察到脑细胞形态结构,有助于对封接过程的判断. 大鼠海马脑片CA1细胞可分为多种类型. 生理条件下,锥体细胞处于静息或自发低频状态,具有膜阻抗低、频率适应现象、后放电等特点;中间神经元自发放电频率高、膜阻抗高、无频率适应现象. 结论: 红外可视膜片钳技术克服了盲法膜片钳的缺陷,实现了实时、直视的特点,可操作性强. 应用该项技术,可根据电生理特性对大鼠海马CA1区细胞作出初步分类.     

新生大鼠心肌细胞培养及电生理特性观察

目的应用原代细胞培养技术,以获取大量具有正常电生理特性的心肌细胞。方法用胶原酶溶液处理1 d龄SD大鼠的心脏,差速贴壁法纯化获得的单个心肌细胞,CO2培养箱中培养8 d后,以膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位和各跨膜离子流。结果细胞培养中,改进了酶溶液的成分、浓度和经典的差速贴壁法作用时间,获得了大量的高纯度单个心肌细胞。在此细胞上,采用电流钳技术,可引导出心室肌动作电位。运用心肌细胞离子通道的电压依赖性和特异阻断剂,在不同的钳制电位和指令电位下,可记录到INa,ICa,Ito,IK等多种离子流。结论改进的细胞培养技术可获得大量的具有正常电生理特性的心肌细胞。     

溶血磷脂酸对豚鼠心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的作用

目的：观察溶血磷脂酸(LPA)对豚鼠心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的作用。方法：用膜片钳实验技术记录胶原酶急性分离的豚鼠心室肌细胞钾通道电流。结果：共记录了33个心室肌细胞的电压依赖性外向K+通道电流发现1.0 μmol•L^-1和10.0 μmol•L^-1 LPA可明显降低K+通道电流的幅值。 结论：LPA可能参与心肌梗塞时心律失常的发生。     

M 3受体激动剂对急性缺血性心肌的保护作用

目的：研究 M 3受体激动剂胆碱对大鼠急性缺血性心肌的保护作用其可能的机制。方法用低 pH 值（pH 6．8）乏氧液来模拟缺血环境,全细胞膜片钳技术记录 L-型钙电流（ICa-L ）变化;激光扫描共聚焦技术观测细胞内钙变化,探讨胆碱对细胞内钙及钙库的影响。结果在膜片钳实验结果显示,与正常组比较,缺血组 ICa-L 电流密度明显增高,应用胆碱后 ICa-L 下降,差异有统计学意义（P＜0．01）;共聚焦实验结果显示,与正常组比较,缺血组细胞内钙升高明显（P＜0．01）,胆碱组细胞内钙升高幅度不明显;预先给予4-DAMP 可部分逆转胆碱抑制细胞 ICa-L 及细胞内钙升高的作用。结论 M3受体参与保护缺血心肌的可能机制为通过抑制缺血心肌细胞 ICa-L ,从而抑制细胞内钙超载。     

一种有效记录人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流的方法

目的：探讨一种有效的记录人心房肌细胞小电导钙激活钾通道（small conductance Ca2＋-activated K＋channels,SK）电流的全细胞膜片钳方法。方法：以人心房肌细胞为研究对象,采用传统全细胞膜片钳技术,记录人心房肌细胞的小电导钙激活钾通道的宏观电流。传统全细胞模式形成后,分别记录在浴液中加入apamin（100 nM）前后的电流,两者相减就得到了apamin敏感的SK2的电流。结果：采用传统全细胞膜片钳技术,能有效记录人心房肌细胞上apamin敏感的宏观电流。该电流是内向整流,去极化激活时,无明显失活现象,无尾电流出现,这些都符合SK2电流特性。结论：本实验提供了一种简单、有效的记录人心房肌细胞SK2宏观电流的方法,为今后深入的研究提供了实验基础。     

肺腺癌细胞调节性容积减小过程及其离子通道机制

目的 观察人肺腺癌细胞调节性细胞容积减小(RVD)的过程,探讨其离子通道机制.方法 用细胞体积测量系统分析人肺腺癌细胞(A549)在细胞外低渗刺激下细胞容积改变;用通道阻断剂和全细胞膜片钳方法 阐明容积敏感性氯通道在RVD中的作用.结果 细胞外低渗刺激使人肺腺癌细胞系A549细胞膨胀并诱发RVD,该RVD过程可被氯通道阻断剂NPPB(100 μmol/L)和钾通道阻断剂CsCl(5 mmoL/L)所阻抑;全细胞膜片钳方法 记录A549细胞容积敏感性氯通道电流呈外向整流特性,电流可被NPPB、DIDS(100 μmol/L)阻抑.结论 人肺腺癌A549细胞具有RVD功能,RVD过程的完成有赖于氯通道和钾通道的平行激活,容积敏感性氯通道参与该RVD过程.