小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定。方法应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定。以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量。结果构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65×108 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达。结论成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础。     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体的构建及其在睾丸间质细胞的表达

目的：构建钙视网膜蛋白（CALB2）基因超表达及小干扰RNA（siRNA）慢病毒载体,观察CALB2对睾丸间质细胞雄激素合成的调节作用。方法：合成超表达及干涉的质粒,转入制备好的细菌感受态细胞,聚合酶链反应（PCR）鉴定阳性重组子后测序验证,确认构建成功的超表达及干涉慢病毒载体。用上述慢病毒载体分别感染MLTC-1及R2C间质细胞,观察感染效率,而后用放射免疫法检测睾酮和孕酮的合成。结果：PCR和基因测序证实LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体构建成功,并可高效感染MLTC-1及R2C细胞。超表达CALB2后,MLTC-1细胞睾酮生成显著增加（P＜0.001）;干涉CALB2表达后,R2C间质细胞孕酮生成显著减少（P＜0.05）。结论：成功构建了calb2基因超表达及干涉慢病毒载体,并可体外转染睾丸间质细胞系。初步结果表明,CALB2可促进间质细胞类固醇激素生成。     

靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建

目的构建靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体。方法针对人ERG基因的mRAN序列,设计特异性干扰序列,两端引入酶切位点,人工合成OligoDNA,退火后与双酶切的pLVX-shRNA2慢病毒载体质粒连接,构建慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-ERGsiRNA,通过测序鉴定连接正确后,以293T细胞包装得到荷载ERGsiRNA基因的慢病毒;根据293T细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染前列腺癌VCaP细胞株,通过实时荧光定量PCR检测ERGmRNA的表达。结果测序结果表明,靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为1.1×108TU/ml。感染VCaP细胞后,实验组和对照组相比ERGmRNA的表达水平显著降低,siRNA对ERG表达的干扰效率为87.46%。结论成功构建靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体。     

PAX2慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的 构建大鼠PAX2慢病毒表达载体,以期在大鼠肾脏中高效、稳定表达.方法 设计引物引入Age I酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-PAX2中扩增小鼠PAX2基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化.用In-Fusion技术将Age Ⅰ内切酶消化后目的片段交换连接入Age Ⅰ酶切的pGC-FU载体,构建PAX2慢病毒表达载体pGC-FU-PAX2.酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-PAX2与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证PAX2在转染293T细胞中表达.结果 通过PCR扩增获得了PAX2基因,将PAX2克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论 成功构建了PAX2慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨PAX2功能奠定了基础.     

慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建

目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株。采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0×109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的m RNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P0.05)。结论成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株。     

抑制 HPV18型 E7蛋白的表达对 Hela细胞生物学特性及 miR-204表达的影响

目的：通过小干扰RNA（ siRNA）抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒（ HPV）18型E7的表达,研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系,探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA,转染Hela细胞,抑制HPV18-E7的表达;采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平,用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡,通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果 pRNAT-HPVE7与两个对照组比较,明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA（ t值分别为2．69、2．46,均P＜0．05）和蛋白（ t值分别为3．93、4．20,均P＜0．05）的表达,细胞周期趋于正常,凋亡率增高（t值分别为－6．87、－6．92,均P＜0．05）,miR-204表达水平也明显升高（t值分别为0．26、0．22,均P＜0．05）。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。     

人miR-1908慢病毒载体构建及在人脂肪前体细胞中的表达验证

目的 构建人miR-1908慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪前体细胞中过表达效果。方法 以人脂肪细胞基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-1908区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-1908的相应表达量。结果 成功构建人miR-1908慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪前体细胞的效率可达到70%以上,miR-1908过表达水平可接近2倍。结论 本研究成功构建了人miR-1908慢病毒过表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪前体细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

人miR-146b慢病毒载体构建及人脂肪细胞中表达验证

目的 构建人miR-146b慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪细胞中过表达效果。方法 以人基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-146b区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-146b的相应表达量。结果 成功构建人miR-146b慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪细胞的效率可达到85%以上,miR-146b过表达水平可接近4倍。结论 本研究成功构建了人miR-146b慢病毒表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

TGF-βⅡR单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白携带miR-29b抗肝纤维化的研究

目的 观察TGF-βⅡR单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白(简称新型载体)携带miR-29b对体外培养肝星状细胞(HSC)的转染效率和治疗效果,为今后肝纤维化基因治疗提供新载体.方法 脂质体、新型载体和慢病毒携带miR-29b治疗体外培养的HSC,荧光显微镜和流式细胞术观察转染效率,实时荧光定量RT-PCR和Western Blot技术分析collagen α(1) (Ⅰ) mRNA和蛋白表达水平.结果 与对照组比较,慢病毒组的转染效率最高,为70％;其次为新型载体组,为58％;最后为脂质体组,为29％.各载体组collagen α1(Ⅰ) mRNA表现出不同的下降,与对照组比较,慢病毒组下降70％(t=6.316,P＜0.01),新型载体组为50％(t=4.082,P＜0.01),脂质体组为38％(t =3.014,P＜0.05).各载体组collagen α1 (Ⅰ)蛋白也表现出不同的下降,慢病毒组下降为59％(t=4.209,P＜0.01);新型载体组为41％(t =4.033,P＜0.01;);脂质体组为27％(f=2.842,P＜0.05).结论 笔者构建的新型载体具有较高的转染效率,并且携带miR-29b具有较好的抗肝纤维化效果.     

EGFR、MMP-9和AQP1在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和水通道蛋白1（AQP1）在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组化sP法检测EGFR、MMP-9和AQP1在上皮性卵巢癌、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织的表达情况。结果EGFR、MMP-9和AQP1在正常卵巢组织中的阳性表达率分别为20．0％、10．0％、10．0％;在卵巢良性肿瘤组织中阳性表达率分别为33．3％、25．0％、20．0％;在上皮性卵巢癌组织中阳性表达率分别为86．0％、84．0％、84．0％。EGFR、MMP-9和AQP1在上皮性卵巢癌组织与正常卵巢和卵巢良性肿瘤组织阳性表达率的差异有统计学意义（X^2EGFR=15．0～16．5,X^2MMP,9=6．6～7．8,X^2AQP1=9．3—9．6,均P〈0．05）。EGFR、AQP1和MMP-9表达在肿瘤的组织学分级和临床分期中差畀具有统计学差畀（X^2EGFR组织学分级=13．5,X^2MMP母组织学分级=11．5,X^2AQPI组织学分级=9．6,X^2EGFR临床分期=13．5,X^2MMP-9临床分期=11．5,X^2AQP组织分级=9．7,均P〈0．05）。结论EGFR、MMP-9和AQP1在上皮性卵巢癌的发生、发展过程中起着重要的作用。     

LncRNA TUG1通过调控miR-196b-5p调控卵巢癌细胞凋亡和放射敏感性分子作用机制

目的 探讨LncRNA TUG1通过调控miR-196b-5p表达对卵巢癌细胞凋亡和放射敏感性的影响及其潜在的作用机制。方法 运用qRT-PCR和Western blot检测卵巢癌细胞株SKOV3、HO8910、OVCAR3和正常卵巢上皮细胞HOSE中miR-196b-5p和TUG1的表达水平。双荧光素酶报告基因分析法验证TUG1可能的靶基因。建立TUG1抑制表达、miR-196b-5p过表达及si-TUG1和anti-miR-196b-5p共转染的SKOV3细胞株,流式细胞术检测细胞凋亡率。采用克隆形成实验检测各组SKOV3细胞不同剂量X射线照射后的存活情况,曲线拟合计算不同剂量辐射后各放射生物学参数。结果 正常卵巢上皮细胞HOSE相比,卵巢癌细胞SKOV3、HO8910及OVCAR3中miR-196b-5p的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),TUG1的表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-196b-5p是TUG1的靶基因。TUG1抑制表达或miR-196b-5p过表达均促进SKOV3细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)并增加其放射敏感性,差异有统计学意义(P<0.05)。抑制miR-196b-5p表达可部分逆转抑制TUG1表达对SKOV3细胞促进凋亡和增强放射敏感性作用。结论 TUG1可负性调控miR-196b-5p的表达,抑制TUG1表达,可促进卵巢癌细胞凋亡,增加细胞放射敏感性。     

IVF周期中外周血淋巴细胞LHCGR mRNA的表达对卵巢过度刺激综合征的预测价值

目的：探讨外周血淋巴细胞人绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR） mRNA的表达水平对体外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者发生卵巢过度刺激综合征（OHSS）的预测价值。方法：单中心的前瞻性病例-对照研究。108例IVF-ET患者在接受控制性超促排卵（COH）过程中呈OHSS高风险的患者42例,其中发生OHSS 19例为A组,未发生OHSS 23例为B组;同期在COH中卵巢反应正常的患者62例为C组,排除COH过程中卵巢低反应者4例。采用聚合酶链反应（PCR）检测人绒毛膜促性腺激素注射日（hCG日）及取卵日（OPU日）外周血淋巴细胞LHCGR mRNA的表达水平。并比较A组、B组、C组的临床特征及临床结局。结果：基础卵泡刺激素（FSH）A组低于C组（P=0.028）。hCG日及OPU日血清雌二醇（E2）A组、B组均高于C组（均P=0.000）。获卵数A组、B组均高于C组（均P=0.000）。A组与B、C组相比,hCG日和OPU日淋巴细胞LHCGR mRNA表达均增高（均P＜0.05）;而B组和C组比较,差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论：外周血淋巴细胞LHCGR mRNA的表达与卵巢反应相关,并在OHSS患者中表达升高,其在预测OHSS发生中的作用值得进一步探讨。     

甲状腺乳头状癌miR－34b基因表达及其启动子区甲基化的临床意义研究

目的：探讨miR－34b基因表达及其启动子区甲基化（MSP）在甲状腺乳头状癌（PTC）中的临床意义。方法：收集2008年10月一2013年1月本院治疗的42例甲状腺乳头状癌患者癌组织标本（实验组）和42例甲状腺腺瘤患者瘤旁组织标本（对照组）,检测两组miR－34bmRNA表达（实时定量PCR法）及miR－34b基因启动子区甲基化（甲基化特异性PCR法）,并对结果进行分析。结果：实验组miR－34bmRNA相对平均表达量（O．84±0．04）,miR－34b基因启动子甲基化阳性率71．4％,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;实验组中不同性别、年龄、肿瘤直径、分期和包膜浸润之间,甲基化阳性率比较差异无统计学意义（P〉0.05）;而存在淋巴结转移甲基化率（88．5％）显著高于不存在淋巴结转移（43．8％）,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：miR－34b基因表达及其启动子区甲基化与PTC发生发展具有密切关系,建议临床深人研究。     

微小RNA-21在乳腺癌细胞中的作用

目的：探讨微小RNA（miR）-21在乳腺癌细胞（MCF7）中的作用。方法：对MCF7细胞转染miR-21,采用免疫组织化学法检测转染后程序性细胞凋亡4（PDCD4）表达;用噻唑蓝（MTT）比色法测转染miR-21后MCF7细胞增殖;流式细胞术检测转染后MCF7细胞凋亡。结果：经免疫组织化学检测,转染组未见染色,对照组细胞胞质呈棕褐色,转染组PDCD4的表达明显低于对照组,MTT法检测转染组细胞活力增加（P〈0.05）。转染组的凋亡率为（3.14±0.24）%,明显低于空白组、空质粒组的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：PDCD4是miR-21的靶基因之一,miR-21的高表达可促进乳腺癌的发展。