筛检重组杆状病毒的工具——绿色荧光蛋白(英)

绿色荧光蛋白（GFP）是来源于Aequorea Victoria水母的含有238个氨基酸的蛋白质，它能在395urn波长下发出绿色荧光，以杆状病毒载体表达的GFP可作为检测重组杆状病毒的标志。     

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

重组蛋白高产的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)工程株的构建

利用基因寻靶技术构建了高产外源蛋白的中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)工程株。将携带 lox P-绿色荧光蛋白融合基因(lox P-GFP)和二氢叶酸还原酶 (DHFR)基因的质粒转染DHFR缺陷型 CHO细胞后 ,根据荧光强度筛选细胞群落。选择出的 16个克隆子 ,能高水平表达 GFP蛋白 ,并且在它们的染色体上携带一个拷贝的质粒 ,将它们用甲氨蝶呤(MTX)处理后可以检查它们由 DHF R介导的基因扩增能力。其中 MK1和 MK2两个克隆子在基因扩增时 GFP表达量得到提高。利用这种细胞 -载体系统 ,可以通过基因寻靶和基因扩增反复获得重组蛋白的高产株。在人单克…     

VEGF183(132-158)肽段作为蛋白缓释药物载体的细胞外基质结合研究

人血管内皮生长因子VEGF183(132-158)肽段含有细胞外基质结合序列与纤溶酶、基质金属蛋白酶以及uPA酶裂解位点,研究该肽段作为一种蛋白药物的缓释载体,在体内既可和细胞外基质结合,又可在体内的相应酶作用下,缓慢释放。该研究以绿色荧光蛋白GFP为指示分子,进一步采用加端PCR方法将VEGF183(132-158)肽段连到GFP的C端,原核表达并纯化该融合蛋白,通过与琼脂糖肝素柱结合实验与冷冻切片的荧光显微镜观察,发现该肽段赋予了GFP蛋白结合琼脂糖肝素柱与细胞外基质的功能,GFP融合蛋白的获得为下一步的体内释放研究打下了基础。     

Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定

目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)基因在烟草基因组中的整合

为了建立转基因植物生产t-PA的新方法，制备了整合有t-PA基因的转基因烟草植株。通过将t-PA cDNA从质粒pGEM-tPA中切下并插入含有CaMV35S及潮霉素筛选 标记的双元载体pCAMBIA1302中，构建成植物表达载体pCA1302NS-tPA，再将重组载体转入农杆菌GV3101中，通过叶盘法转化烟草。对筛选所得的转化植株进行Southern鉴定显示t-PA基因已整合到烟草基因组中。     

人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

HPV阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽PTP的穿膜特性研究

目的：证实宫颈癌细胞特异性细胞膜穿透肽特异性穿膜并优化穿膜条件。方法：将编码人乳头瘤病毒（HPV）阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽（PTP）的cDNA片断与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因片断融合,克隆至原核表达质粒pET15b克隆位点,构建pET15b-GFP-PTP重组原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达GFP-PTP融合蛋白,纯化后的GFP-PTP融合蛋白作用于体外培养的HPV阳性宫颈癌细胞株HeLa,Siha,肺癌细胞株A549及正常脐静脉内皮细胞ECV304。利用合成的标记短肽探讨优化穿膜条件。结果：荧光显微镜观察发现,与融合蛋白GFP-PTP共孵育后的Hela和Siha细胞胞浆及胞核内有绿色荧光均匀分布,而A549及ECV304胞内无绿色荧光。与GFP共孵育的任何细胞内均无绿色荧光。流式细胞术分析结果显示PTP对HeLa,Siha细胞的穿膜效率分别为33.2％和28.9％。10% DMSO处理细胞后可增强PTP特异性穿透HPV阳性宫颈癌细胞株的胞膜并改善胞浆内分布。结论：本研究结果为进一步探讨PTP作为宫颈癌防治的靶向导入载体奠定了基础。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在转基因烟草中的表达

实验室构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）植物表达载体并转化人根瘤农杆菌GV3101。该农杆菌以叶盘法转化烟草，建立表达t-PA的转基因烟草体系。通过对转化植株进行Southern blotting，RT-PCR，Western blotting和纤维蛋白琼脂糖平板（fibrin-agarose plate assay，FAPA）法检测，结果显示，在转基因烟草中成功地表达出有活性的人t-PA。     

慢病毒载体介导不同内部启动子驱动绿色荧光蛋白表达效率

目的在人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)慢病毒载体中引入三种不同的内部启动子来驱动绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达,初步比较内部启动子的效率。方法慢病毒载体三质粒系统中,转移质粒的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接方法和内切酶酶切鉴定。磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T包装细胞。病毒滴度的测定采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数GFP阳性细胞。通过荧光显微镜观察绿色荧光的表达情况判断启动子的效率。结果构建了含PPT元件和含不同内部启动子和GFP的质粒。转染293T细胞后均观察到较强的绿色荧光。表达荧光的293T细胞数以巨细胞病毒(CMV)启动子最多,肝细胞特异性启动子(LSP)较少,泛醌启动子(PUB)介于两者之间。CMV为内部启动子的慢病毒载体滴度5×106I U/ml,其他二种启动子的滴度(1~2)×105I U/ml。结论在所选择的三种内部启动子中,CMV启动子的效率最高,LSP较强,PUB介于两者之间。     

Co-expression of hepatitis C virus polytope–HBsAg and p19-silencing suppressor protein in tobacco leaves

Context: Plants transformed by virus-based vectors have emerged as promising tools to rapidly express large amounts and inexpensive antigens in transient condition.

Objective: We studied the possibility of transient-expression of an HBsAg-fused polytopic construct (HCVpc) [containing H-2d and HLA-A2-restricted CD8+CTL-epitopic peptides of C (Core; aa 132-142), E6 (Envelope2; aa 614-622), N (NS3; aa 1406-1415), and E4 (Envelope2; aa 405-414) in tandem of CE6NE4] in tobacco (Nicotiana tabacum) leaves for the development of a plant-based HCV vaccine.

Materials and methods: A codon-optimized gene encoding the Kozak sequence, hexahistidine (6×His)-tag peptide, and HCVpc in tandem was designed, chemically synthesized, fused to HBsAg gene, and inserted into Potato virus X (PVX-GW) vector under the control of duplicated PVX coat protein promoter (CPP). The resulted recombinant plasmids (after confirmation by restriction and sequencing analyses) were transferred into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 and vacuum infiltrated into tobacco leaves. The effect of gene-silencing suppressor, p19 protein from tomato bushy stunt virus, on the expression yield of HCVpc–HBsAg was also evaluated by co-infiltration of a p19 expression vector.

Results: Codon-optimized gene increased adaptation index (CAI) value (from 0.61 to 0.92) in tobacco. The expression of the HCVpc–HBsAg was confirmed by western blot and HBsAg-based detection ELISA on total extractable proteins of tobacco leaves. The expression level of the fusion protein was significantly higher in p19 co-agroinfiltrated plants.

Discussion and conclusion: The results indicated the possibility of expression of HCVpc–HBsAg constructs with proper protein conformations in tobacco for final application as a plant-derived HCV vaccine.     

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入烟草的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能,对烟草等茄科作物的青枯病假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)具有较强的杀菌效果。人工合成抗菌肽基因(122 bp)转入根癌农杆菌(Agrobnctcrium tumefaciena),感染烟草叶盘,诱导成苗。通过对卡那霉素敏感筛选,胭脂碱脱氢酶检定及抗菌肽片段探针杂交,确认抗菌肽基因已转入烟草。现正研究其在烟草中表达及抗青枯病的可能性。     

过量表达铁蛋白基因的转基因烟草抗Co2＋能力分析

目的：将烟草铁蛋白基因NtFer1的完整cDNA序列克隆到植物表达载体pBI121中,利用农杆菌（Agrobactri-um tumefaciens）介导的叶盘法将NtFer1导入烟草（Nicotiana tobacum L.）基因组。对卡那抗性植株进行PCR-Southern检测,并将进一步经Northern杂交证明NtFer1基因表达量增加的转基因株系进行抗Co2＋分析。结果表明,NtFer1的过量表达提高了转基因植株的抗Co2＋能力。在含150μmol·L-1Co2＋的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为叶绿素含量、POD活性和SOD活性比非转基因株系明显增加,转基因植株MDA含量明显低于非转基因株系。结果表明,NtFer1大量表达能够增强转基因株系抗氧化能力,提高植物抗Co2＋能力。     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

Heterologous expression of a bacterial homospermidine synthase gene in transgenic tobacco: effects on the polyamine pathway

Homospermidine synthase (HSS) is a branch-point enzyme that links the secondary pathway (pyrrolizidine alkaloids) to primary metabolism (polyamines). Since the diamine putrescine is a precursor of homospermidine and nicotine in tobacco, we performed heterologous expression of a bacterial homospermidine synthase gene (hss)in Nicotiana tabacum and determined the effect on free and conjugated polyamine levels. The hss gene from Rhodopseudomonas viridis was placed under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter in Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid in sense and antisense orientation and both hss constructs were transformed into tobacco plants. Expression of the hss gene was verified by "Northern" and "Southern Blot" analysis. 2 transgenic sense lines were generated from 1000 calli which showed weak expression of homospermidine synthase, i.e. 50 pktal/mg protein and 45 pktal/mg protein.These transgenic sense plants showed a significantly decreased content of free spermidine while the pool of conjugated spermidine was not affected.The 2 sense plants exhibited a range of abnormal phenotypes such as dwarfness and stunted growth. Homospermidine was sporadically detectable in wild type tobacco. To our knowledge, this is the first biotechnological approach to express a prokaryotic homospermidine synthase gene in tobacco plants.     

CYP4F3基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建

目的构建细胞色素P450(CYP)4F3基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体。方法设计并合成CYP4F3 siRNA序列,与含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pGCL载体连接产生PscsiCYP4F3慢病毒载体,PCR和测序鉴定。用PscsiCYP4F3、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染人肾上皮细胞系293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并以人肺腺癌A549细胞中CYP4F3mRNA表达水平确定该基因干扰的有效靶点。结果成功构建CYP4F3siRNA的慢病毒载体,并筛选出该基因的有效干扰靶点。结论成功构建人CYP4F3基因RNAi慢病毒载体,为后期研究CYP4F3基因功能奠定基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体