中心组合设计优化必特螺旋霉素合成培养基

将克隆自卡波霉素产生菌的4＂-O-异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌Streptomyces spiratnvceticus F-21的染色体上，构建成一株稳定的生物工程菌WSJ-1-195，它产生的一组以4＂-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分基因工程新型抗生素命名为必特螺旋霉素。针对目前没有适合必特螺旋霉素产生菌的合成培养基，所以本文顺序通过部分因子析因设计法、最速上升实验、中心组合实验，并利用统计学软件SAS V8对实验数据进行分析，确定了必特螺旋霉素合成培养基的组成，为以后对必特螺旋霉素生理生化特性的研究提供基础。经过优化后必特螺旋霉素的发酵效价从173μg／ml提高到1880μg／ml。     

亮氨酸对必特螺旋霉素发酵组分的影响

本文针对必特螺旋霉素发酵主要组分异戊酰基螺旋霉素以及异戊酰基螺旋霉素Ⅲ的提高，在摇瓶培养基试验中，通过一次性添加与分批添加终浓度为15．4mmol／L的亮氨酸，发现分批添加亮氨酸可以维持效价基本不变，而总异戊酰基螺旋霉素与异戊酰基螺旋霉素Ⅲ分别由对照的31．1％和12．0％提高至46．9％和19．5％。通过分析发酵过程的有机酸以及氨基酸的变化规律，讨论了亮氨酸提高必特螺旋霉素主要组分的作用机理，同时在15L发酵罐中对分批添加亮氨酸添加效果进行了验证试验，结果表明，发酵液必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ在96h分别提高至59．91％和21．45％。     

统计学法优化必特螺旋霉素发酵培基养

利用Plackett—Burman设计法析出影响必特螺旋霉素效价的四个最显著的因素，以Box—Behnken设计法及响应面分析法确定了主要因素的最佳浓度，即鱼粉22．8g／L，酵母粉2．44g／L，CoCl29．25mg／L，NaCl9．13g／L，此时必特螺旋霉素效价为2245μg／ml。新配方验证结果表明必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量在96h分别达到2380μg／ml和54％，比原配方分别提高了53％和20％。     

提高基因工程菌产二素链霉菌311—10产生酰化螺旋霉素的研究

基因工程菌产二素链霉菌(Str.ambofaciens)311-10是一株含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌,可发酵直接产生酰化螺旋霉素。经质谱鉴定,所产生的酰化产物为4″—异戊酰、4″—丁酰及4″—丙酰螺旋霉素,并含有50～60％的螺旋霉素组份。为了提高酰化螺旋霉素的含量,研究了17种氨基酸及有关化合物对产二素链霉菌311-10菌株直接产生酰化螺旋霉素的影响。结果显示,在发酵过程中添加一定量α—羟基异丁酸或L—异亮氨酸,酰化螺旋霉素的的百分含量可从对照组的45％分别提高到73％和67％。如同时加入α-羟基异丁酸和L-异亮氨酸.则酰化螺旋霉素的含量可增至88％左右。研究表明含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌能利用L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸作为酰基的供体。从不同发酵时间加入试验表明合适的添加时间为发酵前期24小时左右。提示L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸不只是提供酰化螺旋霉素4”—酰化酶酰基的供体,可能对4″—酰化酶基因的转录起诱导作用。 L—精氨酸能使酰化螺旋霉素组份下降至14％左右,并能抵消α-羟基异丁酸或L-异亮氨酸对酰化螺旋霉素的促进作用。 研究提示控制基因工程菌发酵条件,可以有效地获得所需基因工程产物。     

响应曲面法优化柔红霉素发酵培养基

目的优化培养基,提高柔红霉素发酵效价。方法采用Plackett-Burman法、最陡爬坡试验和Box-Behnken设计,用摇瓶发酵进行实验,利用SAS软件进行二次回归分析。结果 Plackett-Burman设计证明麸质粉(A)、FeSO4·7H2O(B)和NaCl(C)对产量影响较大,通过最陡爬坡试验和响应曲面法得到柔红霉素发酵培养基预测模型为:Y=-16.09+13.55A+231.49B+5.20C-3.59A2+130.00AB-30774B2-0.37AC+102.50BC-1.84C2,从中获得柔红霉素发酵的最优配方为:麸质粉2.0%,FeSO4·7H2O 0.01%,NaCl 1.51%。1500L发酵罐中试放大结果表明:柔红霉素效价提高24%。结论使用响应曲面法可以较大幅度地提高柔红霉素发酵效价。     

响应面法结合满意度函数优化白囊耙齿菌发酵培养基

采用响应面法和满意度函数,以期望值作为响应值,提高白囊耙齿菌发酵的菌丝体干重以及胞内多糖、甘露醇、腺苷和蛋白质的含量.通过单因素法优化白囊耙齿菌发酵培养基中的碳、氮源和无机盐,然后进行部分因子试验考察培养基组分对菌株发酵的影响,并应用中心组合设计试验优化培养基,获得最佳培养基配方(%):乳糖2.94,酵母浸粉1.5,牛肉膏1.5,KH2PO4·3H2O 0.065,MgSO4·7H2O 0.06,NaCl 0.000 8,VB1 0.028 9.模型预测最佳培养基配方下白囊耙齿菌的发酵期望值为0.624,3次验证试验平均值为0.617 7,是优化前的5.27倍,与模型预测值间的误差为1.01%.     

Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响

在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响,证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸,发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异,而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快,达到1.0g/(L.h),胞内丙酮酸积累,丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%,柠檬酸合成酶活性降低41%,发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象,最终效价比对照高出45.3%,而总异戊酰组分则降低了23%,其他酰化组分降低了39.6%;添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%,柠檬酸合成酶活性降低了47%,发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象。最终效价为对照的85%,而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%。添加Leu对初级代谢影响不大,异戊酸在胞外积累,随后被重新吸收利用,最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41%和50%。同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9%,效价和对照基本一致。     

响应面法优化红霉素发酵培养基

采用响应面法对红色糖多孢菌产红霉素发酵培养基进行优化.用Minimum Run Equireolicated Res Ⅳ设计对初始发酵培养基添加的6个影响因素的效应进行评价,选择有显著影响的4个因素,即硫酸镁、甜菜碱、硫酸铜和氯化钴.再用最陡爬坡实验为中心组合实验确定最大响应区间,最后经过响应面分析得到最优化结果,硫酸镁0.106%(w/v),甜菜碱0.0185%(w/v),硫酸铜0.106mmol/L,氯化钴0.0003%(w/v).优化后红霉素生物效价比优化前提高了30%.     

利用强启动子PermE*提高4"-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平

目的 提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导.方法 构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力.结果 在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍.结论 在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平.     

响应面法优化林可霉素发酵培养基

采用响应面法对林可霉素产生菌林肯链霉菌SL-98-2#-8的发酵培养基进行优化.首先,采用Plackett-Burman方法对影响发酵各因素的效应进行评价,筛选出有显著效应的5个因素:淀粉、葡萄糖、KH2PO4、豆饼粉和玉米浆;并通过响应面分析法优化这5个主要因素.优化后这5个因素的最佳含量为淀粉2.1%;玉米浆0.33%;葡萄糖8.5%;豆饼粉2.53%;KH2PO40.022%.采用优化后的培养基进行摇瓶发酵,林可霉素的含量为3700ug/ml,比优化前提高了12%.     

HPLC法测定醋酸艾塞那肽注射液中有关物质及主药的含量

目的建立醋酸艾塞那肽注射液主药及有关物质的含量测定方法。方法醋酸艾塞那肽含量测定采用TSK Gel G2000SW柱(300 mm×7.5 mm),检测波长为214 nm,流动相为水-乙腈-0.2 mol.L-1柠檬酸-三氟乙酸(体积比78∶17∶5∶0.2)。有关物质测定采用Polylc PolysulfoethylAsartamide色谱柱(100 mm×4.6 mm,3μm);梯度洗脱:流动相A为0.5 mol.L-1氯化钠与10 mmol.L-1磷酸二氢钠-乙腈(体积比56∶44,用磷酸调pH值至2.0),流动相B为10 mmol.L-1磷酸二氢钠-乙腈(体积比56∶44,用磷酸调pH值至2.0);检测波长为214 nm;流速为1 mL.min-1。结果醋酸艾塞那肽含量测定方法的检测限为0.1 ng,艾塞那肽质量浓度在0.052～1.04 g.L-1(r=0.999 8)内与峰面积呈良好线性关系,平均回收率为100.1%(n=9),RSD为0.77%,稳定性试验表明艾塞那肽溶液在室温条件下8 h内稳定。有关物质测定方法的检测限为2 ng,定量下限为5ng,专属性实验表明各杂质峰与主成分峰得到了有效的分离3,批样品的有关物质的含量检测结果分别为1.37%、1.64%1、.63%。结论本法快速、简便、分离效果较好,适用于醋酸艾塞那肽的含量测定及有关物质的质量控制。     

RP-HPLC法同时测定桂龙咳喘宁胶囊中甘草酸和环磷酸腺苷的含量

目的建立桂龙咳喘宁胶囊中两种成分甘草酸和环磷酸腺苷含量的测定方法。方法采用色谱柱:Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇(A)-0.01 mol.L-1磷酸二氢钾溶液(B),梯度洗脱程序为0～12 min,体积分数为10%的A;12～30 min,体积分数为70%的A,流速:1.0 mL.min-1,检测波长:250 nm,柱温:30℃。结果环磷酸腺苷和甘草酸质量浓度在2.0～200.0 mg.L-1内与峰面积线性关系良好,平均回收率分别为95.9%和92.7%,RSD分别为2.9%和3.1%(n=3)。结论该方法可作为桂龙咳喘宁胶囊的质量控制方法之一。     

氨氯地平与比索洛尔在Beagle犬体内的药动学相互作用研究

目的探讨氨氯地平与比索洛尔联合用药时有无显著的药动学相互作用。方法采用自身对照、随机交叉试验方法,将Beagle犬分成3组,每组2条,分别按试验周期服用氨氯地平对照药物、比索洛尔对照药物以及氨氯地平与比索洛尔复方药物。采用HPLC-UV和HPLC-FLD分别测定不同时间点氨氯地平与比索洛尔的血药质量浓度,计算药动学参数。结果氨氯地平单用时ρmax为(110.2±6.3)μg.L-1,AUC0-∞为(1 984±594)μg.h.L-1;联合用药时ρmax为(102.0±23.5)μg.L-1,AUC0-∞为(2 016±394)μg.h.L-1。比索洛尔单用时ρmax为(35.77±8.17)μg.L-1,AUC0-∞为(230.2±93.9)μg.h.L-1;联合用药时ρmax为(31.74±7.57)μg.L-1,AUC0-∞为(224.8±106.1)μg.h.L-1。故与两种药物单独使用相比,联合用药时的ρmax、AUC差异没有统计学意义。结论氨氯地平与比索洛尔联合用药不存在显著的药动学相互作用。     

RP-HPLC法测定人血浆中拉莫三嗪及药动学

目的建立RP-HPLC法测定人血浆中的拉莫三嗪,并将此方法应用于拉莫三嗪片在健康受试者体内的药动学研究。方法血浆样品经乙酸乙酯提取后,采用Kromasil C18柱分离,流动相为乙腈-20 mmol.L-1 KH2PO4(体积比为25∶75),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为306 nm。测定了11名健康受试者口服拉莫三嗪片50 mg后不同时刻血浆中拉莫三嗪的浓度,采用DAS 2.0软件以非房室模型计算药动学参数。结果拉莫三嗪的线性范围为10.0～2 000.0μg.L-1;日内和日间精密度均小于8.0%,准确度(relative error,RE)在±2.6%以内,提取回收率大于59.1%。拉莫三嗪的主要药动学参数:t1/2为(39.1±8.2)h,tmax为(3.3±1.8)h,ρmax为(469.6±152.4)μg.L-1,AUC0-t为(22 424.6±6 952.6)μg.h.L-1,AUC0-∞为(25 573.2±7 196.4)μg.h.L-1。结论该方法适用于拉莫三嗪人体药动学研究。     

血浆中雷尼替丁和铋的药动学和生物等效性研究

目的建立高效液相色谱(HPLC)和电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)分别测定人血浆中雷尼替丁和铋质量浓度的方法 ,并应用该法进行雷尼替丁和铋在健康人体内的药动学特征研究和复方盐酸雷尼替丁片生物等效性评价。方法采用HPLC法和ICP-MS技术,分别测定20名健康男性受试者经口给予复方盐酸雷尼替丁片和复方雷尼替丁胶囊后不同时刻血浆中雷尼替丁和铋的质量浓度,分别绘制血药质量浓度-时间曲线,并计算主要药动学参数。结果受试制剂和参比制剂中雷尼替丁的主要药动学参数如下:tmax分别为(1.9±0.5)和(2.1±0.6)h,ρmax分别为(492.8±276.7)和(466.5±224.4)μg.L-1,t1/2分别为(2.9±1.6)和(2.8±1.0)h,用梯形法计算,AUC0-t分别为(2 548.3±895.6)和(2 377.5±887.0)μg.h.L-1,AUC0-∞分别为(2 562.9±912.8)和(2 377.5±887.0)μg.h.L-1,雷尼替丁的相对生物利用度平均为(111.6±35.4)%。受试制剂和参比制剂中铋的主要药动学参数如下:tmax分别为(0.4±0.2)和(0.3±0.1)h,ρmax分别为(56.0±40.2)和(53.3±37.9)μg.L-1,t1/2分别为(6.9±2.6)和(7.2±2.3)h,用梯形法计算,AUC0-t分别为(151.8±118.9)和(156.3±117.9)μg.h.L-1,AUC0-∞分别为(153.1±120.2)和(157.7±119.3)μg.h.L-1,铋的相对生物利用度平均为(95.3±16.2)%。结论复方盐酸雷尼替丁片与复方雷尼替丁胶囊两种制剂具有生物等效性。     

高效液相色谱法测定吡美拉唑血药浓度及其药代动力学

目的 建立测定吡美拉唑血药浓度的高效液相色谱(HPLC)方法,并初步考察其在人体内的药代动力学特性。方法 受试者口服吡美拉唑10 mg后,分别于给药前,给药后0.5, 1, 1.5, 2, 4, 8, 12, 21, 36, 48, 60和72 h采集血样,通过HPLC吡美拉唑的血药浓度,并应用3P87软件拟合并计算药代动力学参数。结果 吡美拉唑的线性范围为25~4000 μg·L^-1,最低检测浓度为25 μg·L^-1,回收率95.2%~107.7%,日内精密度均<6.9%,日间精密度<10.2%。吡美拉唑的主要药代动力学参数:t_1/2为(22.58±1.59)h, AUC_0-72为(29 089±8886)μg·h·L^-1, Cl/F为(338.9±114.0)L·h^-1, t_max为(2.67±1.54)h, c_max为(1585±469)μg·L^-1。结论 吡美拉唑在人体内吸收快,半衰期较长,有效作用时间长,疗效好。     

尼莫地平在健康男性国人中药物代谢动力学变异性

对２６名健康男性国人ｐｏ６０ｍｇ尼莫地平普通片后药代动力学进行研究．Ｃｍａｘ，Ｔｍａｘ，ｔ１／２，ＭＲＴ和ＡＵＣ分别为６９±３４μｇ·Ｌ－１，１．１±０．３ｈ，２．２±０．６ｈ．３３±０９ｈ和１８６±７３μｇ·ｈ·Ｌ－１．ＡＵＣ和Ｃｍａｘ有较大的个体差异．对ＡＵＣ值作频数和机率图分析结果表明存在双态分布．提示尼莫地平药代动力学存在多态性．根据ＡＵＣ值大小，将受试者分成快代谢型和慢代谢型两类，结果显示受试者大多（２４／２６）属于快代谢型（ＡＵＣ＞３００μｇ·ｈ·Ｌ－１）．     

液质联用法测定奶粉中单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的含量

目的建立奶粉中单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的含量测定方法。方法通过有机溶剂提取和C18SPE小柱对样品进行处理,采用RP-HPLC与MS联用法测定。色谱柱为Waters C4300A柱(2.1 mm×100 mm,3.5μm),流动相为乙酸铵-甲醇溶液,梯度洗脱,MS检测器选用负离子SIR模式。结果分析测定无干扰,GM1质量浓度在0.500~50.0μg.L-1内与峰面积呈良好的线性关系,定量限为0.500μg.L-1,批内与批间RSD均小于5%,回收率在94.4%~113.8%内。结论该法专属性强、灵敏度高、结果准确、重现性好,适用于奶粉中GM1的定量分析。     

ATP敏感性钾通道在U50488H抑制去氧肾上腺素诱导的乳大鼠心肌细胞肥大中的作用

目的研究ATP敏感性钾通道(KATP)在κ-阿片受体激动剂U50488H抑制乳大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型,应用去氧肾上腺素(PE)10μmol.L-1诱导心肌细胞肥大。细胞处理分为正常对照组、PE10μmol.L-1模型组、5-羟基癸酸(5-HD)100μmol.L-1组,格列本脲(Gli)50μmol.L-1组、PE10μmol.L-1+U50488H1μmol.L-1组、PE10μmol.L-1+Gli50μmo.lL-1+U50488H1μmo.lL-1组和PE10μmo.lL-1+5-HD100μmo.lL-1+U50488H1μmol.L-1组,细胞培养液中先加入Gli50μmol.L-1或者5-HD100μmol.L-1,30min后再加入U50448H1μmol.L-1,30min后最后加入PE10μmol.L-1,48h后进行指标检测,Lowry等法检测心肌细胞蛋白质含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;Western印迹法测定KATP通道Kir6.2亚基的表达。结果与正常对照组相比,PE10μmol.L-1模型组使心肌细胞总蛋白质含量比正常细胞增加了52.2%,细胞体积增加了95.0%,而Kir6.2的表达没有明显变化。与PE10μmol.L-1模型组相比,细胞加入U50488H1μmol.L-1后,心肌细胞总蛋白质含量和细胞体积分别降低了42.3%和47.9%,但是Kir6.2表达增加了39.2%。与PE10μmo.lL-1+U50488H1μmol.L-1组相比,在非选择性KATP通道阻滞剂Gli50μmol.L-1或线粒体KATP通道阻滞剂5-HD100μmol.L-1存在的情况下,Kir6.2表达分别减少了49.3%和52.1%,U50488H抑制PE诱导的心肌细胞肥大作用减弱,并且两组之间没有显著差异。结论 U50488H可能是通过开放KATP通道,主要是线粒体KATP通道来抑制PE诱导的乳大鼠心肌细胞肥大。     

猕猴静脉推注加滴注重组人碱性成纤维细胞生长因子后的药代动力学

目的　研究猕猴静脉推注加滴注 (2 0 %∶80 % )10、2 0和 4 0 μg·kg- 1重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhbFGF)后血清抗原浓度 时间变化和药代动力学并与静脉推注比较。方法　ELISA法 ,测定浓度的专一性、灵敏度、重现性和测定范围 ,血清回收率和精密度均良好。结果　猕猴血清内源性水平(14 4± 10 1)ng·L- 1;静脉推注后即刻浓度最高 ,分别为 (33± 16 ) ,(5 6± 8)和 (91± 2 8) μg·L- 1,滴注期间稳定在 2 2～ 2 7,37～ 4 4和 6 3～ 6 5 μg·L- 1,提示控制药量和滴注速率可使浓度维持在不同水平。停药后浓度迅速下降 ,平均末端相半衰期 (t1/ 2 )为 2 .6～2 .9h。AUC( 0～∞ ) 随剂量成正比增大 ,全身清除率Cls不变。结论　在给药量范围内表现为线性药代动力学。静脉推注药代动力学与推注加滴注组相近。