超声微泡促腺病毒载体转染MDR1基因效率的体外实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在体外促进腺病毒载体介导的MDRl基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,并初步探讨其安全性.方法 根据是否加入超声微泡造影剂和超声辐照将分选的兔骨髓单个核细胞分为常规培养组(A)、腺病毒MDRl基因转染组(B)、腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(C)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染组(D)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(E).收集各组细胞,应用RT-PCR法、流式细胞技术等分别从基因、功能及细胞生物学特性等方面检测外源性MDR1基因在骨髓单个核细胞内的功能性表达及安全性.结果 收获高滴度的Ad5-MDR1腺病毒载体并成功制备腺病毒微泡造影剂;RT-PCR结果 显示,除A组外其余4组在194 bp处均观察到特异性MDR1电泳条带,证实外源性MDR1基因通过腺病毒载体整合到细胞基因组中,且E组MDR1电泳条带的光密度比值明显高于B、C、D组(P<0.05);柔红霉素排出实验证实外源性MDR1基因表达产物P-gP有药物外排泵功能,且E组P-gp阳性率最高(P<0.05),而柔红霉素阳性率显著降低;一定强度的超声辐照及微泡造影剂对骨髓单个核细胞的细胞周期无明显影响.结论 低频超声波击碎微泡造影剂,能促进以腺病毒为载体介导的外源性MDR1基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,且安全可行.     

多药耐药mdr-1基因体外转染兔骨髓造血细胞及其表达与功能的研究

目的：探讨浓缩病毒上清转染法在体外将多药耐药mdr—1基因转入兔骨髓造血细胞的条件及检测转染后mdr—1基因在兔骨髓造血细胞中的表达及功能。方法：用秋水仙碱(90ng／ml)筛选含人类全长mdr—1cDNA的产病毒包装细胞PA317—HaMDR1／A1后进行细胞培养并制备浓缩病毒上清。采集新西兰大白兔骨髓并分离富含造血细胞的单个核细胞。骨髓造血细胞与浓缩病毒上清及细胞因子组合共培养。采用免疫组织化学法检测转染率，PCR法检测外源性mdr—1基因的整合，柔红霉素(daunorubicin DNR)泵出试验检测导入的mdr—1基因的功能。结果：秋水仙碱筛选后，产病毒包装细胞P糖蛋白(P-g;ucp[rpteom P-gp)表达增强：外源性mdr—1基因能成功的导入兔骨髓造血细胞，转染2日、4日、6日的转染率分别为22％、37％、39％，但转染4日组细胞生长状态最好；转入的mdr—1基因能发挥药物外排泵的功能。结论：采用浓缩病毒上清转染法能成功的将外源性mdr—1基因导人兔骨髓造血细胞中并获得稳定的功能性表达，为进一步研究mdr—1基因转染骨髓造血细胞后自体回输在大剂量化疗中对骨髓保护作用的研究提供了依据。     

多药耐药基因转染对荷瘤小鼠骨髓造血细胞的保护作用

目的探讨MDR1基因转染荷瘤小鼠骨髓单个核细胞（BM-MNCs）后在体内的分布和对骨髓造血细胞的作用。方法将32只H22肝癌荷瘤BALB/c小鼠随机分为4组：正常对照组（不照射不回输）、空白对照组（照射并回输生理盐水）、阴性对照组（照射并回输未转染的BM-MNCs）、转染实验组（照射并回输已转染的BM-MNCs）,每组8只。阿霉素超剂量化疗,监测化疗过程中各组外周血细胞和肿瘤体积的变化,用RT-PCR法和免疫组化法检测外源性人MDR1基因和P-gp在荷瘤小鼠体内的表达和分布。结果化疗后各组红细胞和血小板均无明显变化,差异无统计学意义（P〉0.05）;转染实验组白细胞数于化疗后第4周降至（3.32&#177;0.26）,与化疗前（6.64&#177;0.39）相比减少有统计学意义（P〈0.05）,化疗后第3周起转染实验组白细胞数高于阴性对照组,增高有统计学意义（P〈0.05）;化疗3周后与3个对照组相比转染实验组肿瘤体积较小,减小有统计学意义（P〈0.05）;外源性人MDR1基因和P-gp在骨髓和外周血单个核细胞有表达和分布,在心、肝、肺、脾和肾等组织中无表达和分布;肿瘤组织中无外源性人MDR1基因分布,有P-gp表达。结论MDR1基因转染荷瘤小鼠BM-MNCs后在超剂量化疗中对骨髓造血功能有保护作用,外源性MDR1基因在心、肝、肺、脾和肾等组织中无表达。     

多药耐药基因转染骨髓单个核细胞移植联合化疗治疗乳腺癌的实验研究

目的研究外源性人多药耐药基因(human multidrug resistance gene 1,hMDR1)转染骨髓单个核细胞(mono-nuclear cells,MNCs)移植联合超剂量表阿霉素化疗在4T1乳腺癌治疗中的骨髓保护和治疗作用。方法用携带目的基因hMDR1和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)报告基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-hMDR1-GFP)转染原代培养的MNCs以获取hMDR1基因修饰的MNCs(MNCs-rAd-hMDR1-GFP),将修饰后的MNCs移植到4T1乳腺癌模型体内,在表阿霉素超剂量化疗中观察骨髓造血功能的保护和肿瘤的治疗效果。结果 hMDR1基因成功转入小鼠骨髓单个核细胞,体外转染率达26.26%;转染细胞移植后能定植于受体骨髓中并功能性表达。在超剂量化疗中,hMDR1基因能有效保护受体骨髓的造血功能,荷瘤动物能耐受3倍剂量表阿霉素化疗,外周血白细胞数能维持在(5.7±0.6)×109/L;同时超剂量化疗能迅速杀灭肿瘤细胞,使荷瘤动物存活时间明显延长(P<0.05),治愈率明显提高(P<0.05)。结论 hMDR1基因转染骨髓造血细胞移植能明显提高受体骨髓对化疗药物的耐受性,联合超剂量化疗能快速、有效的杀灭肿瘤细胞,提高恶性肿瘤的治愈率。     

bcl-2基因过表达致急性髓系白血病对柔红霉素耐药机制的初步探讨

目的 探讨bcl-2基因过表达导致人急性髓系白血病对柔红霉素耐药的机制.方法 通过分子克隆技术构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,将其转染人急性髓系白血病U937细胞,分正常对照组、空载体对照组、转染组,与柔红霉素培养24 h,采用CCK-8法检测细胞增殖率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化,从而比较转染bcl-2基因前后,U937细胞对柔红霉素敏感性的变化.结果 成功构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,转染入U937细胞,PCR证实其转染效果;CCK-8法检测结果显示U937/ bcl-2组细胞存活率显著高于对照组和空载体对照组;bcl-2基因过表达降低caspase-3片段的裂解活化,降低U937细胞对柔红霉素的敏感性.结论 bcl-2过表达抑制caspase-3激活、抑制柔红霉素杀伤U937细胞,导致细胞对柔红霉素耐药.bcl-2可作为临床治疗急性髓系白血病的靶点.     

mdr1基因转染K562细胞株的高效及安全性实验

目的：mdr1基因转染K562细胞株，了解转染的持续稳定性、功能性及安全性。方法：磷酸钙沉淀法建立一株双向性产病毒包装细胞，浓缩病毒上清液法感染K562细胞．分别用集落筛选法、流式细胞仪及SP免疫组化法检测转染率，柔红霉素泵出实验及MTT法测定外源性Pgp功能，流式细胞仪测细胞周期及PI分析，免疫组化测bcl-2、c-myc的表达，柱形图、折线图及配对t检验进行统计学分析。结果：①最高转染率为34％，秋水仙碱筛选后达84％．②外源性mdr1基因可持续表达4月多，但表达率及强度逐渐降低。④转染的mdr1基因产物Pgp具有外排泵功能①被转染的K562细胞获得1．46～2．22倍的多药耐药功能。⑤转染行为对靶细胞生长、增殖、凋亡呈一过性、轻度的、可逆的影响。结论：mdr1基因转染K562细胞获得外源性Pgp高效、持久、功能、安全地表达，这为进一步研究mdr1基因修饰的骨髓移植在化疗中保护骨髓免受化疗损害奠定了基础．     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

超剂量化疗治疗mdr1基因转染骨髓移植的VX2肝癌兔疗效和毒副作用研究

目的:mdr1基因转染的骨髓造血细胞自体移植后,观察VX2肝癌兔超剂量化疗中mdr1基因的骨髓保护及肿瘤治疗作用;并观测超剂量化疗对心脏的毒副作用.方法:mdr1基因转入兔骨髓单个核细胞并自体移植;阿霉素化疗,观测外周血白细胞数、VX2肝肿瘤的生长及转移、心脏结构和功能变化,评价mdr1基因对受体骨髓的保护作用、超剂量化疗对肿瘤的治疗作用及对心脏的毒副作用.结果:通过转染的自体骨髓移植将mdr1基因导入受体骨髓;超剂量阿霉素化疗后,实验组荷瘤兔外周血白细胞可维持在(4.26±1.03)×109/L,肿瘤能被有效杀灭,荷瘤动物的生存时间明显高于对照组(P＜0.05);同时也观察到超剂量化疗对心脏的严重损害.结论:mdr1基因能明显提高骨髓对化疗的耐受性;超剂量化疗能有效杀灭肿瘤,同时也对非造血系统脏器造成严重损害.     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

多药耐药基因1C3435T多态性对汉族儿童外周血单个核细胞mRNA表达的影响

目的 探讨多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)C3435T多态性与健康汉族儿童外周血单个核细胞中mRNA表达的关系.方法 以130例(男性83例,女性47例)无亲缘关系的中国健康汉族儿童为研究对象,采用PCR-RFLP技术检测其MDR1基因C3435T位点的基因型,实时荧光定量PCR法检测其外周血单个核细胞中MDR1 mRNA表达水平.结果 130例儿童中,51例为CC型,63例为CT型,16例为TT型,基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);CC、CT、TT各基因型组间外周血单个核细胞MDR1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05).结论 汉族儿童中MDR1基因C3435T多态性对外周血单个核细胞中mRNA表达无显著性影响.汉族儿童C3435T位点多态性不能作为推测MDR1表达水平的依据.     

多药耐药基因(MDR1)转染小鼠骨髓造血细胞表达及功能研究

目的：探索含人多药耐药基因（ＭＤＲ１）全长ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染小鼠骨髓造血细胞转染时间及转染效率的关系。方法：采用逆转录病毒上清法转染小鼠骨髓造血细胞，依据转染时间不同分为２日组及４日组，分别行ＰＣＲ法检测外源ＭＤＲ１基因；免疫组化法检测ＭＤＲ１基因表达，柔红霉素排出试验检测表达外源基因的功能。结果：ＰＣＲ方法证实转入的外源ＭＤＲ１基因可整合入小鼠骨髓造血细胞基因组中；免疫组化法检测转染率最高达３３％，转染４日组转染率大于转染２日组转染率（Ｐ＜０．０５）；柔红霉素排出试验证实转入外源基因表达产物可行使正常功能。结论：逆转录病毒上清法可有效转染外源ＭＤＲ１基因入骨髓造血细胞中；表达产物可行使正常生理功能；在转染４天时间内，转染率随转染时间延长而增高。     

超声消融联合自体干细胞移植治疗糖尿病足临床分析

目的观察血管内超声消融联合自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足的疗效。方法选择32例糖尿病足患者手术。首先抽取自体骨髓干细胞260 mL,分离出单个核细胞悬浊液40 mL。采用经皮股动脉穿刺或显露切开插入超声消融导管,在动脉造影监视下进行血管内超声消融,后将干细胞悬浊液注射小腿缺血肌肉内局部。结果32例患者术后跛行距离增加,冷、凉感觉得到改善。结论血管内超声消融联合自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足是一种有效的方法。     

自体骨髓单个核细胞心肌内移植的实验研究

目的：观察自体骨髓单个核细胞（BMMNC）在动物模型心肌微环境中的存活和分化情况，探索该方法应用至临床的可行性。方法：选取成年新西兰兔共20只，随机分为四组。无菌状态下取胫骨骨髓15ml，采用改进后的密度梯度离心法分离出BMMNC，荧光染料CFSE作细胞标记后备用。正中切口进胸，心肌内注入上述备用细胞悬液。于术后1、2、4、8周先后处死四组动物，取心脏标本冰冻切片在共聚焦显微镜下观察局部含荧光细胞的存活发育情况。结果：移植后4周可观察到与心肌纤维平行的荧光带，部分标本血管内壁中观察到了荧光细胞。结论：自体BMMNC心肌内移植可在心肌微环境的诱导下分化为心肌样细胞及血管内皮细胞。改进后的BMMNC分离纯化方法过程简便、可靠，处理过程无毒性，获得的细胞纯度和活性较高，该方法可应用于临床研究。     

超声消融联合干细胞移植治疗老年动脉硬化性闭塞症

目的 观察血管内超声消融联合自体骨髓干细胞移植治疗老年性下肢动脉硬化性闭塞症的疗效。方法 22例老年性下肢动脉硬化闭塞症的患者，男13例，女9例。平均年龄65岁。手术：首先抽取自体骨髓干细胞260mL，分离出单个核细胞悬浊液40mL。采用经皮股动脉穿刺或显露切开插入超声消融导管，在动脉造影监视下进行血管内超声消融。而后将干细胞悬浊液注射小腿缺血肌肉内局部。结果 22例患者静息痛缓解，跛行距离增加，冷、凉感觉得到改善。结论 血管内超声消融联合自体骨髓干细胞移植治疗老年动脉硬化性闭塞症，是一种有效的方法。     

Liposome-mediated functional expression of multiple drug resistance gene in human bone marrow CD34<Superscript>+</Superscript> cells

Summary The expression and functional activity of multiple drug resistance (MDR1) gene in human normal bone marrow CD34⁺ cells was observed. Human normal bone marrow CD34⁺ cells were enriched with magnetic cell sorting (MACS) system, and then liposome-mediated MDR1 gene was transferred into bone marrow CD34⁺ cells. Fluorescence-activated cell sorter was used to evaluate the expression and functional activity of P-glycoprotein (P-gp) encoded by MDR1 gene. It was found that the purity of bone marrow CD34⁺ cells was approximately (91±4.56) % and recovery rate was (72.3±2.36) % by MACS. The expression of P-gp in the transfected CD34⁺ cells was obviously higher than that in non-transfected CD34⁺ cells. The amount of P-gp in non-transfected CD34⁺ cells was (11.2±2.2) %, but increased to (23.6±2.34) % 48 h after gene transfection (P<0.01). The amount of P-gp was gradually decreased to the basic level one week later. The accumulation and extrusion assays showed that the overexpression of P-gp could efflux Rh-123 out of cells and there was low fluorescence within the transfected cells. The functional activity of P-gp could be inhibited by 10 μg/ml verapamil. It was suggested that the transient and highly effective expression and functional activity of P-gp could be obtained by liposome-mediated MRD1 transferring into human normal bone marrow CD34⁺ cells. CAO Wenjing, female, born in 1968, Doctor in Charge     

Liposome-mediated Functional Expression of Multiple Drug Resistance Gene in Human Bone Marrow CD34＋ Cells

Myelosuppressionisanimportantdose limitingfactorformostofchemotherapeuticagentsinclinicalpractice.OverexpressionofP glycoprotein (P gp)encodedbyMDR1geneisaccompaniedbyfunctionaldrugresistance.TheexpressionofP gpisconsistent lylowinnormalbonemarrowcells,an…     

深冻同种异体骨移植联合骨髓单核细胞移植治疗骨肿瘤性骨缺损

目的：评价骨肿瘤病变切除后应用深低温冷冻同种异体骨移植联合自体骨髓单核细胞移植修复骨缺损的治疗效果;方法：回顾性分析2004年1月至2009年1月在我院骨科骨肿瘤病变的124例患者,其中采用同种异体骨联合自体骨髓单核细胞移植植骨61例（联合骨髓单核细胞移植组）;单纯同种异体骨植骨63例（单纯植骨组）;结果：联合骨髓单核细胞移植组移植骨界限模糊时间和消失时间均短于单纯植骨组。术后6、12、24个月时联合骨髓单核细胞移植组骨密度明显高于单纯植骨组。结论：同种异体骨联合自体骨髓单核细胞移植,组织抗原性减弱,能明显促进骨融合和骨缺损的愈合。     

Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischemia

Background Many treatment options for lower limb ischemia are difficult to apply for the patients with poor arterial outflow or with poor general conditions. The effect of medical treatment alone is far from ideal, especially in patients with diabetic foot. A high level amputation is inevitable in these patients. This study aimed to explore the effect of transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells on the treatment of lower limb ischemia and to compare the effect of intra-arterial transplantation with that of intra-muscular transplantation.
Methods In this clinical trial, 32 patients with lower limb ischemia were divided into two groups. Group 1 （16 patients with 18 affected limbs） received transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells by intra-muscular injection into the affected limbs; and group 2 （16 patients with 17 affected limbs） received transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells by intra-arterial injection into the affected limbs. Rest pain, coldness, ankle/brachial index （ABI）, claudication, transcutaneous oxygen pressure （tcPO2） and angiography （15 limbs of 14 patients） were evaluated before and after the mononuclear cell transplantation to determine the effect of the treatment.
Results Two patients died from heart failure. The improvement of rest pain was seen in 76.5% （13/17） of group 1 and 93.3% （14/15） of group 2. The improvement of coldness was 100% in both groups. The increase of ABI was 44.4% （8/18） in group 1 and 41.2% （7/17） in group 2. The value of tcPO2 increased to 20 mmHg or more in 20 limbs. Nine of 15 limbs which underwent angiography showed rich collaterals. Limb salvage rate was 83.3% （15/18） in group 1 and 94.1% （16/17） in group 2. There was no statistically significant difference in the effectiveness of the treatment between the two groups.
Conclusions Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells is a simple, safe and effective method for the treatment of lower limb ischemia,     

单剂G-CSF动员自体骨髓有核细胞移植治疗糖尿病足

目的探讨经单剂粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后的骨髓有核细胞移植治疗糖尿病足的效果。方法自2004年5月-2008年2月对解放军总医院第309临床部、徐州市中心医院、河北医科大学第一附属医院、北京市中医医院、河北唐山工人医院的69例糖尿病足患者（69条患肢）随机分组,骨髓组直接采集自体骨髓200mL,单剂G-CSF动员组在采集骨髓前1d给予G-CSF 2μg/kg,采集骨髓100mL,骨髓组采集200mL,分离骨髓有核细胞,检测骨髓有核细胞总数,流式细胞仪检测CD34＋细胞百分比,将分离的骨髓有核细胞移植于患者患肢腓肠肌。结果足部疼痛改善率动员组为89.7%（35/39）,骨髓组为90.0%（27/30）;两组所有患者在治疗后腿部疼痛均有不同程度改善,动员组1-3d所有患肢（39/39）冷感均有不同程度改善,骨髓组26/30条患肢在1-10d有不同程度改善,两组患者的患肢经皮氧分压均有不同升高。结论利用单剂G-CSF动员患者骨髓可有效提高骨髓采集物中的有核细胞数量,可减少患者骨髓采集量,不影响糖尿病足疗效。