C端序列的删除对非出血重组蛇毒纤溶酶的影响

【目的】研究C端序列对非出血重组纤溶酶(rFⅡ)特异性、活性和热敏感性的影响。【方法】通过SOEing PCR方法构建删除C端序列的突变体，突变体和rFⅡ分别在P．pastoris中诱导表达。表达和纯化的蛋白用SDS—PAGE和Westeren blot进行鉴定。之后分析其生化特性。【结果】rFⅡ及突变体通过SDS-PAGE和Westeren blot得到证实。生化分析揭示：①突变体对显色底物N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA的催化效率(Kcat／Km)是rFⅡ的1．9倍；②突变体和rFⅡ对氧化的胰岛素B链拥有共同的优先裂解位点，可是在随后的裂解中开始展现差异：③突变体显示了更高的纤(原)活性；④热处理表明突变体相较rFⅡ对温度的增加更敏感；⑤通过圆二色谱测量，突变体的螺旋比例有所增加。【结论】删除的序列参与rFⅡ的特异性、活性和热敏感性。该序列可作为下一步优化的候选序列。     

重组蛇毒纤溶因子特异性相关突变体的构建、表达和纯化

目的通过重组蛇毒纤溶因子特异性相关突变体的构建、表达和纯化,初步考查其特异性变化。方法SOEing PCR方法构建突变体,突变体在P.pastoris酵母中诱导表达。表达蛋白经过柱纯化,纯化蛋白用SDS—PAGE和Western blot鉴定,并用MALDI—TOF初步分析其作用于氧化胰岛素B链的特异性。结果SDS—PAGE和Westeren blot证实得到纯化的突变体。MALDI—TOF质谱分析揭示,rFⅡ及突变体对氧化胰岛素B链的早期裂解都发生在第12～13位点,但次级的裂解模式有所不同。结论删除的序列可能与rFⅡ的特异性相关。     

基于增殖诱导配体新型抗肿瘤分子的构建及初步筛选

目的构建针对APRIL的免疫抑制分子,并对其原核表达蛋白进行纯化及活性筛选.方法将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变并插入TEL Th表位序列,突变体用pQE-80L/DH5α原核表达系统进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析,最后检测纯化蛋白对Raji细胞增殖的影响.结果成功构建并表达了4种sAPRIL突变体:C端引入HEL Th表位的sAPRIL突变体(Ⅰ)、N端引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅱ)、C端缺失45bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅲ)、N端缺失45 bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅳ).SDS-PAGE电泳、Western印迹分析均检测到相应的特异蛋白带.用Ni-NTA系统成功纯化表达的突变体蛋白.细胞试验表明,突变体Ⅰ、Ⅱ纯化蛋白具有明显的促细胞增殖活性,而突变体Ⅲ、Ⅳ纯化蛋白没有促细胞增殖活性.结论在4种sAPRIL突变体中初步筛选到不具有促细胞增殖活性的APRIL免疫抑制分子,为下一步确定该分子的免疫抑制功能奠定了物质基础.     

人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础.[方法]以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5mutl基因,将其克隆进表达载体pET-22b( )中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b( )/K5 mut1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2 -His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定.[结果]PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mutl基因片段,正确插入pET-22 b( )载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量M1≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L.[结论]成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白.     

刚地弓形虫MIC2突变体的构建及其特性分析

目的利用基因定点突变的方法将刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)的767位氨基酸的碱基定点突变,蛋白相互作用技术分析突变体的特性。方法利用基因定点突变的方法,将MIC2蛋白羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(tryptophan,W)的碱基突变为丙氨酸(alanine,A)的碱基,PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段;构建MIC2C W/A/p GEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白。以该蛋白和MIC2C蛋白(未突变蛋白)为探针蛋白与弓形虫裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2C W/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白;GST pull-down实验产物分析显示GST-MIC2C W/A蛋白的产物中未见蛋白条带,而未突变蛋白的产物中有一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体识别。结论在体外获得了MIC2突变体;MIC2突变体不能沉降弓形虫裂解液中的醛缩酶,即MIC2突变体失去了与醛缩酶作用的特性。     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

抗人凝血因子Ⅷ-C1C2区单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人凝血因子Ⅷ（FⅧ）C1C2区单克隆抗体（mAb）,并对其进行生化和生物学鉴定。方法采用基因重组技术表达FⅧ-C1C2区蛋白（rFⅧ-C1C2）,以rFⅧ-C1C2免疫8周龄Balb/C小鼠,小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,ELISA法筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗rFⅧ-C1C2mAb的细胞株,并对mAb进行生化和免疫学鉴定。结果获得一株抗rFⅧ-C1C2区单克隆抗体阳性克隆2B11,命名为SZ-133。琼脂糖双扩散鉴定为IgG1类,Westernblot法证实SZ-133可与rFⅧ-C1C2区蛋白及重组的全长FⅧ特异性结合,但不影响FⅧ的凝血活性。结论表达了rFⅧ-C1C2,并制备出了抗人凝血因子Ⅷ的单克隆抗体SZ-133,它能特异识别血浆及重组的FⅧ,有可能用于基础和临床应用研究。     

前列腺特异性膜抗原基因片段在酿酒酵母中的诱导表达及意义

[目的]分析前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因片段在酿酒酵母中的诱导表达情况,以便进一步探讨重组人PSMA的免疫活性并完成抗前列腺癌PSMA蛋白疫苗的制备.[方法]应用基因重组技术将人PSMAcDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT-PSMA,转化酿酒酵母菌株INVSc1,尿嘧啶筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测.[结果]成功构建了PSMA的酵母真核表达重组子pYES2/NT-PSMA,并在酿酒酵母INVSc1中得到有效表达,Western blot显示两个特异性的人重组PSMA全蛋白片段,相对分子质量分别为Mr=100×103及Mr=85×103.[结论]人PSMA基因片段能够在酿酒酵母中表达并进行翻译后糖基化修饰,为下一步进行抗前列腺癌PSMA疫苗的研制奠定了良好基础.     

蝰蛇(缅甸亚种)毒凝血因子X激活物FVe-1的分离纯化与理化活性的研究

[目的]从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离纯化一种凝血活性因子X激活物FVe-1,并研究其理化性质、序列测定以及凝血活性.[方法]应用阳离子交换层析、分子凝胶过滤层析分离纯化蛇毒,采用MALDI质谱测定法测定分子质量,等电聚焦电泳测定等电点,Edman降解法测定蛋白N末端氨基酸序列,发色底物法和SDS-PAGE等方法测定FVe-1的酶学特征和凝血活性.[结果]从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离得到的F Ve-1为单体蛋白,相对分子质量为13 808,等电点4.6,0.5 mg FVe-1的凝血活性与1.5625 u的凝血酶或与54.93 ng RVVX的凝血活性相当;可激活FX,但对凝血酶和纤维蛋白原无作用;酶活性的适宜pH为6.5～ 7.5,适宜温度为25 ～ 60℃;为钙依赖性,凝血活性可被EDTA和DTT抑制;FVe-1的N端序列为NH2-N-L-Y-Q-F-G-E-M-I-N;具有呈剂量依赖性的促血浆凝固作用.[结论]从蝰蛇(缅甸亚种)毒纯化出一种F Ve-1是一个凝血因子X的激活物,可激活凝血因子X,但对凝血酶和纤维蛋白原的作用微弱.     

血管紧张素转换酶基因插入 /缺失多态性与 PAI-1活性的相关性

[目的]研究血管紧张素转换酶( ACE)基因插入 /缺失( ID)多态性与血浆 PAI-1活性的关系.[方法]用 PCR方法扩增 93例心肌梗死患者及 87例健康体检者 ACE基因特异性片段,同时应用发色底物法测定 PAI-1活性.[结果] ①心肌梗死组 ACE DD基因型频率 32.3%和 D等位基因频率 54.3% ,高于对照组 12.6%和 37.4%, P均 < 0.01; ACE基因型分布与年龄、性别、体重指数、血压、胆固醇、甘油三脂、血糖等无关.②心肌梗死组血浆 PAI-1活性( 0.85± 0.19) AU/mL,高于对照组( 0.66± 0.20) AU/mL, P< 0.01.③心肌梗死组 DD基因型血浆 PAI-1活性高于 ID基因型及Ⅱ基因型 P均 < 0.01; ID型血浆 PAI-1活性亦高于Ⅱ型 P< 0.05.对照组 DD基因型血浆 PAI-1活性高于Ⅱ基因型 P< 0.05;而 DD型血浆 PAI-1活性虽高于 ID型, ID型亦高于Ⅱ型,但差异无统计学意义.[结论] ① ACE DD基因型可能是心肌梗死发生的独立危险因素性;② PAI-1水平可能受 ACE基因 ID多态性的影响, ACE基因型可能通过影响纤溶平衡而引起心肌梗死.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的：动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法：选用2--3kg新西兰大白兔64只，分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组。每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果：表皮扩张后经历--由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生，功能由静止转向活跃，胶原纤维碎裂成片，弹力纤维部分断裂，炎症细胞浸润；扩张后1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复。显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后12周、24周，成纤维细胞趋于稳定、形态狭长，部分胶原排列紊乱，部分有似癜痕样改变。结论：扩张刺激可致兔皮肤创伤。扩张后真皮不可完全修复。     

芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用

目的观察芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用。方法30只Long-Evans大鼠用动脉结扎法造成视网膜缺血模型,其中治疗组20只腹腔注射芹黄素,对照组10只注射溶媒二甲基亚酚。用视觉电生理仪检查视网膜功能恢复情况。结果芹黄素治疗组视网膜功能恢复明显好于对照组(P<0.05)。结论芹黄素能促进大鼠缺血视网膜的功能恢复。      

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

人体寄生虫学多媒体教学效果的初步评估

通过分析多媒体辅助教学方法与传统教学方法在人体寄生虫学教学中的应用,指出多媒体辅助教学对于提高教学质量效果显著,受到了绝大部分同学的赞同和欢迎.     

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

头孢他啶用于胸外科感染的疗效分析

目的 观察和评价头孢他啶（泰得欣）应用于普通胸外手术的临床疗效和安全性。方法 采用对比试验，观察2005年8-10月96例普胸手术预防和治疗的疗效和不良反应。结果 泰得欣在预防和治疗术后感染中总有效率95．9％，不良反应发生率为5．2％。结论 泰得欣临床效果满意，使用安全，值得在普胸手术中选用。     

骨淋巴管瘤病1例报告

患者女,19岁,体检发现全身多处固执破坏4个月。影像学检查：平片及CT平扫检查：双侧髂骨、耻骨、股骨颈及股骨上段均可见多发大小不等的低密度影,略呈膨胀性,边界清楚,部分可见硬化边。双侧肱骨上段、肩胛骨近关节盂处骨质及股骨下段、右胫骨近端、左腓骨中上段可见多个囊性骨及右侧锁骨亦可见多发局限性低密度减低区、略呈膨胀性（图1、5）。MRI平扫：脊柱可见多个囊状长T1长T2信号,部分略呈膨胀性。（图2～4）