人胚胎生殖细胞移植大鼠急性心肌梗死区的存活及分化

目的 观察人胚胎生殖细胞移植于大鼠急性心肌梗死区后的存活率和增殖分化能力,探讨人胚胎生殖细胞异种异体移植的可行性.方法 取5～9周人胚胎生殖脊细胞,分离、体外培养获得胚胎生殖细胞;用SD大鼠建立心肌梗死模型,分为对照组、移植组.分别在移植后1 d和1、2、4周处死大鼠,以抗人细胞核抗体MAB1281作为示踪剂,观察转录因子Nkx-2.5在移植大鼠心脏组织的阳性表达;分析人胚胎生殖细胞在宿主体内转化为心肌细胞的能力.结果 成功建立大鼠心肌梗死模型;移植组心肌梗死区抗人细胞核抗体MAB1281和转录因子Nkx-2.5均呈阳性表达,对照组均为阴性表达.结论 人胚胎生殖细胞植入心肌组织后,不仅在心肌内存活而且表现出向心肌细胞分化的特性.     

人胚胎生殖细胞移植于梗死心肌后不同时期心肌特异转录因子GATA-4的表达

目的:探讨人胚胎生殖细胞(hEGCs)移植入急性心肌梗死大鼠心肌组织后,移植细胞早期心肌特异转录因子GATA-4的表达。方法:取5~10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,进行人EG细胞的组织块原代及传代培养,以传四代的人EG细胞为移植细胞。40只SD大鼠随机分为两组,移植组将获得的人EG细胞移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌边缘;对照组用同样的方法给急性心肌梗死大鼠注入PBS。于移植后1天,1、2、4周处死大鼠,用免疫组化方法检测心肌特异转录因子GATA-4在移植细胞的表达。结果:移植后1天,1、2、4周移植组均有移植细胞稳定存活,GATA-4的表达在移植1天时呈弱阳性,1周及2周时呈阳性,4周时强阳性;对照组均未检测出移植细胞及心肌细胞转录因子。结论:随着移植时间的延长,移植细胞GATA-4表达呈增强趋势,移植后4周表达强度最大。     

人原始生殖细胞的分离和培养

目的 探讨体外分离培养人原始生殖细胞的条件和方法.方法 分离、培养2～3个月人胚胎的成纤维细胞,经60Co照射后作为饲养层;从5～9周人胚胎的生殖嵴和肠背系膜组织中分离原始生殖细胞,培养在含有bFGF、LIF和Forskolin的人胚胎成纤维细胞饲养层上;同时采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测人原始牛殖细胞阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4以及特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZL的表达,并进行类胚体培养.结果 分离的人原始生殖细胞在饲养层上可以增殖形成典型的鸟巢状集落;细胞染色体均为正常的二倍体核型;阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性,同时检测到生殖干细胞特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZI.表达.人原始生殖细胞在悬滴培养时能够形成类胚体,表明其具有多项分化潜能.结论 用人胚胎成纤维细胞作为饲养层进行体外培养人胚胎生殖嵴和肠背系膜组织,分离的原始牛殖细胞形成EG细胞集落,初步鉴定为人胚胎生殖细胞.     

大鼠胚胎上胚层干细胞的分离培养研究

目的 获取SD大鼠胚胎中附植后的胚胎上胚层干细胞(EpiSCs),并就影响SD大鼠EpiSCs(SDEpiSCs)分离与培养的组织来源、胎龄、细胞因子等条件进行探讨,从而探索适宜SD大鼠EpiSCs分离培养的实验体系,为下一步SD大鼠EpiSCs的建系提供实验研究基础.方法 以昆明小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,分别取5.5日胎龄的囊胚和7.5日胎龄囊胚上胚层(Epiblast),用添加白血病抑制因子(LIF)或活化素(activin)的基础培养基进行原代培养,分别采用机械法和胰酶消化法对克隆集落进行传代培养.最后通过碱性磷酸酶染色对克隆集落进行鉴定分析,并检测其体外分化能力.结果 培养于LIF培养基和activin培养基中的囊胚均发生严重分化.培养于LIF培养基中的Epiblast也发生了严重的自发分化,而在activin培养基中,Epiblast形成SDEpiSCs原代集落.经机械法传代获得AKP染色阴性、能形成拟胚体的SDEpiSCs.结论 利用细胞因子activin,结合机械传代法可从7.5日胎龄SD大鼠胚胎中获得SDEpiSCs.     

猪胚胎生殖细胞分化实验研究

目的 利用维甲酸(RA)和二甲基亚砜(DMSO)诱导猪胚胎生殖细胞(EG细胞)分化,证明猪胚胎生殖细胞能够在体外分化为多种组织细胞.方法 利用悬浮培养和无饲养层培养,将猪胚胎生殖细胞分化为拟胚体,再将拟胚体分别培养于添加维甲酸(Retinoic acid, RA)和二甲基亚砜(Dimethylsulphoxide, DMSO)诱导剂的培养基中培养,诱导胚胎干细胞分化.结果 当悬浮培养时猪EG细胞形成拟胚体,再经RA和DMSO诱导分化为类桑椹胚体、类ES样细胞集落、神经样细胞和滋养层样细胞.结论 猪胚胎生殖细胞能够在体外分化为多种组织细胞,证明猪EG细胞具有多能性.     

以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较

目的:比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化.方法:分离、培养3～4 mo hELF,观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化,以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞,计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)和抗阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4).结果:经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长,形态维持更好;以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞,集落形成率没有明显差异;两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异.结论:在培养人EG细胞时,hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势.     

EGF对原始生殖细胞来源小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响

目的观察表皮生长因子对原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响。方法以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层,从原始生殖细胞中分离克隆小鼠胚胎干细胞的过程中,在基础细胞培养液中加入不同浓度的表皮生长因子,观察小鼠胚胎干细胞集落形成数和各组的最高传代数。结果表皮生长因子添加与否对原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞原代培养无显著的影响,而对后继培养有显著影响。结论在原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞分离的过程中,可以不添加表皮生长因子,而在胚胎干细胞的后续传代中,尤其对于较高代细胞的克隆过程中添加表皮生长因子有利于细胞的生长。     

人原始生殖细胞体外培养的初步研究

目的 :探讨人原始生殖细胞体外培养条件 ,初步建立人原始生殖细胞体外培养体系及鉴定其部分生物学特性。方法 :从受精后 4～ 12周的人胚中分离原始生殖嵴 /腺获得原始生殖细胞 ,以昆明种小白鼠胚胎成纤维细胞为饲养层 ,在多种细胞因子的共同作用下培养。结果 :获得大量的原始生殖细胞集落。传至 6代后 ,细胞集落呈典型的鸟巢状 ,碱性磷酸酶检测呈阳性 ,表达SSEA 1,SSEA 3,SSEA 4 ,TRA 1 6 0和TRA 1 81抗原 ,同时在体外能自发分化为多种细胞。结论 :初步建立人原始生殖细胞体外培养体系 ,成功的将人原始生殖细胞在体外传 6代 ,仍保持未分化集落的生物学特性     

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的　观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法　小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果　六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论　六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。     

两种来源小鼠胚胎干细胞的分离与培养

从小鼠早期胚胎和原始生殖细胞中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:取小鼠3.5天胚龄的囊胚,培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,3 ～4天后分离出内细胞团再培养;取13.5天胚龄胚胎的生殖嵴组织,分离出原始生殖细胞,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养;观察两种来源的细胞集落生长行为,并用AK P染色鉴定细胞集落.结果:两种来源的细胞集落均具有ES细胞鸟巢状典型特征,AKP染色阳性.结论:两种来源的小鼠胚胎干细胞均可分离和培养.     

胎儿心肌细胞移植重建大鼠梗死心肌

目的　探讨将胎儿心肌细胞移植到心肌梗死后大鼠心肌重建的可行性及效果。方法18只雄性Wistar大鼠经左冠状动脉前降支永久性结扎建立前壁心肌梗死模型 (MI组 ) ,设假手术对照组 6只。胎儿心肌细胞被分离及培养 5d ,证实为活的心肌细胞。大鼠心肌梗死手术后第 5天再分为两组 ,细胞移植组 (7只 ) 2× 10 6心肌细胞注入受体大鼠心肌坏死瘢痕中 ,另一组为培养基注入组 (6只 )。在细胞移植前及细胞移植后 6 0d± 3d中行超声心动图检查 ,评价左心室重构及心功能。然后处死大鼠并收集心脏 ,进行组织学及免疫组化检查 (免疫组化染色抗体为抗人平滑肌α 肌动蛋白 )。结果　光镜显示移植的人的胎儿心肌细胞存活在梗死的心肌中 ,并在胎儿心肌细胞和宿主心肌细胞之间存在闰盘连结。平滑肌α 肌动蛋白通常在胚胎心肌细胞中存在而在成年鼠心肌细胞中不存在 ,移植的细胞通过抗人平滑肌α 肌动蛋白免疫组化染色呈阳性反应得到证实。系列超声心动图研究发现 ,细胞移植阻止了梗死瘢痕心肌变薄、左室进一步扩张及心脏收缩功能恶化。而对照培养基注入组超声心动图显示 ,左室壁瘢痕变薄 ,左室明显扩张 ,左室收缩功能进行性恶化。结论　胎儿心肌细胞可以被移植并在大鼠梗死心肌中存活。胎儿心肌细胞移植到大鼠心肌梗死区域可明     

THE EFFECT OF BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR SLOW-RELEASE MICROCAPSULES ON ANGIOGENESIS IN INFARCTED RABBIT MYOCARDIUM

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　　Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ (ｂＦＧＦ)ｉｓａｎｉｎｔｅｎｓｅｌｙｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｓｗｅｌｌａｓａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ 1 7 2ｋＤｐｅｐ ｔｉｄｅ ,ｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｓ ,ｃａｒｄｉａｃｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｓ .ＩｎｖｉｖｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｂＦＧＦｌｅａｄｓｔｏｍｙｏｃａｒｄｉｕｍａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｔｈａｔｈａｓｂｅｅｎｄｅｍｏｎ…     

IGF-1, bFGF EXPRESSION AND VASCULAR REGENERATION IN ACUTE INFARCTED CANINE MYOCARDIUM AFTER AUTOLOGUS SKELETAL MUSCLE SATELLITE CELL IMPLANTATION

Objective To study the cell growth factor secretion and vascular regeneration in acute in-farcted myocardium after autologous skeletal muscle satellite cell implantation. Methods Autologous skeletal muscle satellite cells from adult mongrel canine were implanted into the acute myocardial infarct site via the ligated left anterior descending (LAD) artery. Specimens were harvested at 2, 4 , 8 weeks after implantation for the expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1), basic fibroblast growth factor ( bFGF) and the vascular density. Results The expression of IGF-1, bFGF and the vascular density in skeletal muscle satellite cell implant group were higher than that in the control group. Conclusion The skeletal muscle satellite cells, after being implanted into the acute myocardial infarction, not only showed myocardial regeneration, but also showed the ability to secrete the cell factors, hence representing a positive effect on the regeneration of the infarcted myocardium.     

经心外膜向心肌移植自体骨髓单核细胞治疗急性心肌梗死的实验研究

目的 在小型猪动物模型上探讨自体骨髓单核细胞移植到心肌梗死局部对心功能和梗死心肌代谢的影响.方法 结扎小型猪冠状动脉前降支建立急性心肌梗死动物模型.分为3组:空白对照组、心肌梗死1周后处理组及心肌梗死2周后处理组,处理组经心外膜向心肌注射自体骨髓单核细胞.然后检测各项指标.结果 空白对照组与处理组心尖室间隔下部室壁增厚率差异具有统计学意义.显影细胞区域冰冻切片免疫组化测定,证实自体骨髓单核细胞分化细胞转化为心肌或内皮细胞并证实其存活增殖功能.结论 经心外膜向梗死区域的心肌移植自体骨髓单个核细胞,可以改善梗死区域心肌的收缩功能.移植的单个核细胞可以在梗死区域中存活,增殖,分化和迁移,增加梗死区域的微血管数量,再生、再造心肌.     

小鼠胚芽干细胞的分离与培养

目的：探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的最佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力最佳时期。方法：分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况。结果：①在含15％胎牛血清的DMEM／F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子（LIF）或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6d后出现鸟巢状胚芽千细胞集落。传4代后集落逐渐减少、变小。6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4d即可见EGC集落形成。传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24h后细胞呈对数生长。培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长。第5代的细胞增殖速度减慢。结论：与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞;第3代细胞的活力最好。     

碱性成纤维生长因子对急性心肌梗死血管生成和碱性成纤维生长因子及血管内皮生长因子表达的作用

目的探讨心肌内注射碱性成纤维生长因子(bFGF)对急性心肌梗死(MI)血管生成和bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)表达的作用。方法24只犬建立急性MI模型后随机分成对照组(MI区注射生理盐水15ml)和实验组(MI区注射50mg bFGF与生理盐水的混合液15ml)。每组观察4个不同的时间点(术后第1天、第3天、第10天、第17天)。各组分别在处死前应用敏感编码技术行磁共振电影成像。免疫组织化学方法检测各组心肌细胞中bFGF和VEGF的表达及微血管数量。结果实验组左心室射血分数自第10天明显增加;除第1天外各个时间点的微血管数量实验组比对照组明显增多;心肌缺血区对照组bFGF和VEGF的表达增多。结论局部心肌内注射bFGF有促进MI区域毛细血管形成及提高左心室功能的作用。     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

大鼠趋化素样因子2 mRNA在心肌梗死大鼠心脏中的表达

目的：观察大鼠趋化素样因子2(rCKLF2)的mRNA在心肌梗死后大鼠心脏组织的表达。方法：构建大鼠心肌梗死模型，分别于心肌梗死后1d、3d、1周、2周、3周(每个时间点各5例)，取心肌梗死周边区心肌组织，提取组织总RNA，逆转录后行竞争性PCR，了解rCKLF2 mRNA的表达情况。结果：rCKLF2 mRNA在梗死心肌周边区的表达于术后上调，并呈动态变化，1周达峰值，为正常的6．7倍。结论：CKIF2可能参与心肌梗死的病理生理过程。     

碱性成纤维细胞生长因子诱导大鼠缺血心肌血管新生的作用

目的　探讨局部应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠急、慢性缺血心肌血管新生的作用。　方法　健康雄性Wistar大鼠,采用开胸结扎左冠状动脉前降支法制备急、慢性心肌梗死模型,并随机分为bFGF组和对照组(n =8) ,bFGF组以0 .0 2mL(2 0 μg/kg ,0 .2 5mg/mL)造模时或造模1个月后于结扎处局部注射,对照组以等容积生现盐水处理。注射后1个月观察血流动力学参数、心肌梗死面积和侧支微血管数目的变化。　结果　bFGF组心率、左室舒张末压明显低于对照组(P <0 .0 1)、平均动脉压、左室收缩压、左室最大收缩速率明显高于对照组(P <0 .0 1) ;bFGF组心肌微血管数明显多于对照组(P <0 .0 1) ;急性心肌梗死模型bFGF组心肌梗死面积明显小于对照组(P <0 .0 1) ,慢性心肌梗死模型bFGF组心肌梗死面积与对照组比较差异无显著性(P >0 .0 5 )。　结论　局部应用bFGF能明显促进缺血心肌血管新生,缩小急性心肌梗死面积,改善血流动力学。