CEA启动子启动双自杀基因CD/TK重组AdEasy XL腺病毒构建

目的构建含有CEA启动子(CEApromoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒。方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物。在2μlT4DNAligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插入pAT.Cp.C的MCS,形成pAT.Cp.C.T。5μgpAT.Cp.C.T经4μlPmeI线化后,转化BJ5183AD1,1μlPacI酶切鉴定。重组AdEasy质粒转化XL10Gold细胞,大量扩增提取纯化,转染5×105AD293细胞,荧光显微镜观察,制备带有Cp.C.T重组腺病毒(recombinantadenoviruswithCp.C.T,RACp.C.T),测定病毒滴度。结果pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T双酶切以及PCR均见长约500bp的Cp,1300bp的CD,1100bp的TK。对照质粒DNA转化BJ5183AD1效率为7.36×106cfu/μg。线化pAT.Cp.C.T转化BJ5183AD1,形成重组AdEasy质粒DNA,PacI酶切见典型长约3.0或4.5kb与30.0kbDNA片断。重组质粒转染AD293出现绿色荧光。RACp.C.T滴度为5.67×107pfu/ml。结论RACp.C.T构建正确;AdEasyXL腺病毒载体系统转导Cp.C.T具有高效性,易于观察转染效果。     

小鼠胚胎切割及半胚体外培养

目的 为基因型完全相同的同卵双胞脂人类动物模型的建立积累基础资料。方法C57BI/6J雌性小鼠与KM雄性小鼠交配,见栓3．5d采集小鼠晚期桑椹胚和早期囊胚,应用显微手术刀直接分割法进行胚胎二等份分割,所得半胚体外培养,观察其发育情况。结果 晚期桑椹胚分割成功率是91．3％,半胚发育率为57.1％,早期囊胚分割成功率约为89．2％,半旺发育率为71.2％。结论 C57BI/6J小鼠与KM小鼠的F1代胚胎经切割后能在体外良好发育,该资料可用于同卵双胞胎分化发育的研究及人类双胞胎动物模型的制作。     

用融合自杀基因“靶向治疗”CEA阳性肿瘤

用融合自杀基因“靶向治疗”ＣＥＡ阳性肿瘤许道松１伍新尧１钟女奇２夏云飞３吴凝华３罗超权１郭语彬１黄冰２（中山医科大学１生化教研室；广州，５１００８９２实验动物中心；３附属肿瘤防治中心放疗科）主题词癌胚抗原；启动区（遗传学）；基因疗法；胞苷脱氨酶／遗传...     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

[目的]探讨CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因.[方法]以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组,未转染者为对照组,5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)组系列质量浓度:10、8、6、4、2、0μg/mL;更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组系列质量浓度:5、4、3、2、1、0μg/mL;两药联合应用的系列质量浓度:(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg/mL.光镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate,GIR)及半数抑制浓度(IC50).病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养,给予5-Fc5μg/mL或/和GCV 10μg/mL,噻唑蓝法测定细胞GIR.[结果]对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低,5-Fc组IC50为2 400 μg/mL,GCV组为3 500μg/mL.实验组随5-Fc与GCV剂量增加,对细胞的杀伤作用明显增加,5-Fc组IC50为5.75μg/mL,GCV组为3.50 μg/mL,两者同时应用相当于5-Fc1.90 μg/mL GCV 0.95 μg/mL,细胞对5-Fc的敏感性提高417.4倍,对GCV的敏感性提高1 000倍.病毒杀伤Lovo细胞具有明显的"旁观者"效应,联合应药组的"旁观者"效应明显高于单独应用组.[结论]双自杀基因细胞毒效应以及"旁观者"效应均高于单一自杀基因.     

RNA干扰对乳腺癌细胞株MCF-7/Adr多药耐药性的逆转

目的研究小分子干扰RNA对乳腺癌耐药细胞株MCF7/Adr多药耐药性的逆转作用。方法设计针对mdrl基因的SiRNA,转染进MCF-7/Adr细胞;用荧光定量PCR检测mdrlmRNA的表达,流式细胞仪分析Pgp表达,MTT法检测阿霉素对MCF-7/Adr细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果该SiRNA能使耐药细胞株MCF-7/Adr的mdrlmRNA和Pgp表达水平分别显著下调(P<0.01),并使阿霉素对MCF7/Adr的IC50显著降低(P<0.01)。结论RNA干扰可逆转乳腺癌MCF7/Adr细胞株的多药耐药性。     

如何做好实验动物细菌质量检测

严格认真做好实验动物细菌质量检测,保障实验动物质量,为医、教、研提供高标准、高质量的实验动物.以国家标准GB/T14926-2001<实验动物微生物质量检测方法>为依据,制定与严格执行SOP;不断提高检测工作者的专业理论和操作技能水平;全面加强实验室管理等.将这三方面工作中的每个环节都认真严格做好,才能把整个检测工作做好.     

姜黄素对MPP~+诱导PC12细胞凋亡的影响

目的观察姜黄素对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的影响。方法采用透射电镜,hoechst染色和流式细胞仪(FCM)观察PC12细胞凋亡,间接免疫荧光流式细胞术检测PC12细胞bcl2的表达。结果PC12细胞自然凋亡率为(15±01)%,05mmol·L-1、1mmol·L-1和2mmol·L-1MPP+作用24h后,PC12细胞凋亡率分别为(441±38)%、(549±21)%和(822±26)%;20μmol·L-1和40μmol·L-1姜黄素对PC12细胞作用24h后无明显凋亡诱导作用,但可分别使05mmol·L-1MPP+处理组细胞凋亡率由(441±38)%下降到(341±38)%和(179±15)%(P<001);PC12细胞经20μmol·L-1姜黄素处理24h后,其bcl2表达率由正常对照的(3643±790)%增加到(7673±860)%(P<001)。结论姜黄素可以抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡,其作用机制之一可能与促进bcl2的表达有关。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

【目的】探讨CEA启动子(CEA promoter，Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)与胸苷激酶(thymidine kinase，TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因。【方法】以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组，未转染者为对照组，5-氟胞嘧啶(5-fluomcytosine，5-Fc)组系列质量浓度：10、8、6、4、2、0μg／mL；更昔洛韦(ganciclovir，GCV)组系列质量浓度：5、4、3、2、1、0μg／mL；两药联合应用的系列质量浓度：(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg／mL。光镜观察细胞形态，噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate，GIR)及半数抑制浓度(IC50）。病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养，给予5-Fc 5μg／mL或，和GCV10μg／mL，噻唑蓝法测定细胞GIR。【结果】对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低，5-Fc组IC50为2400μg／mL，GCV组为3500μg/mL。实验组随5-Fc与GCV剂量增加，对细胞的杀伤作用明显增加，5-Fc组IC50为5．75μg／mL，GCV组为3．50μg／mL两者同时应用相当于5-Fc 1．90μg/mL GGV0．95μg／mL，细胞对5-Fc的敏感性提高417．4倍，对GCV的敏感性提高1000倍。病毒杀伤Lovo细胞具有明显的“旁观者”效应，联合应药组的“旁观者”效应明显高于单独应用组。【结论】双自杀基因细胞毒效应以及“旁观者”效应均高于单一自杀基因。