靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立

目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体,感染SH．SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进-步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA（miRNA）的重组干扰质粒pcDNATM6．2．GW／miR和阴性对照质粒pcDNATM6．2．GW／neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测NHE-1mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR—NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数（MOI）值梯度试验确定靶向人NHE-1RNAi腺病毒感染SH—SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH．SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内DH值。结果聚合酶链反应（PCR）提示最佳靶向人NHE-1RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1mRNA表达;靶向人NHE．1RNAi腺病毒感染SH．SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1miRNA腺病毒感染24、48和72h后SH—SY5Y细胞内pH值分别为5．97±0．03、5．98±0．02和5．98±0．02;空载体对照组为6．05±0．04、6．0d±0．07和6．03±0．05;空白对照组为6．03±0．06、6．05±0．0d和6．034-0．04。不同测量时间点,SH—SY5Y细胞内DH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（24h：P=0．002,0．015;48h：P=0．030,0．012;72h：P=0．018,0．010）;但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点（24、48和72h）SH—SY5Y细胞内DH值差异无统计学意义（P=0．762）。结论最佳靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供-种有效工具。     

细胞内pH降低对β分泌酶和γ-分泌酶的影响研究

目的研究细胞内pH值下降的情况下,β分泌酶和早老素-1的表达及活性的变化。方法培养人源性神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞,用RNA干扰技术和无血清培养分别制造细胞内酸化模型;实验分成4组,即正常细胞组、NHE-1基因敲低组、阴性对照组、无血清培养组。运用荧光分光光度计测定各组细胞内pH值,并通过Real-Time PCR和Western Blotting分别检测β分泌酶和早老素-1 mRNA及蛋白的相对表达量,通过ELISA检测β分泌酶和早老素-1的活性。结果 NHE-1基因敲低组及无血清培养组较正常细胞内pH值降低(P0.05),阴性对照组细胞内pH值无明显变化;与正常、阴性对照组相比,NHE-1基因敲低组β分泌酶mRNA表达为5.65±0.33,蛋白表达为0.37±0.030;早老素-1 mRNA表达1.75±0.04,蛋白表达分别为0.70±0.01,无血清培养组β分泌酶mRNA表达为2.40±0.55,蛋白表达为0.32±0.031;早老素-1 mRNA表达1.39±0.03,蛋白表达分别为0.68±0.08,其表达及活性均明显增强(P0.05);阴性对照组细胞与正常细胞比较,β分泌酶和早老素-1 mRNA和蛋白表达及活性均无明显变化(P0.05)。结论细胞内pH降低能够增强β分泌酶的表达和活性;因早老素-1被认为是γ-分泌酶的主要成分和活性中心,因此推测细胞内pH降低也能够增强γ-分泌酶的表达和活性,从而影响APP的剪切,增加Aβ生成。     

抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中。该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响。因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素。 目的：为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成。 材料：293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA。 方法：构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子。通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件。Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列。 主要观察指标：被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率。 结果：pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1：1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率。靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高。能够抑制40%正常基因表达。 结论：实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素。为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础。     

RNAi抑制STAT3对胶质瘤干细胞的生长抑制作用

目的 建STAT3的RNAi载体干扰STAT3的表达,在体内外研究对胶质瘤干细胞的影响。方法 构建STAT3基因shRNA的腺病毒表达载体,感染人胶质瘤干细胞。采用RT -PCR、Western blot检测STAT3基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测干细胞的增殖、凋亡,并观察对荷瘤裸鼠的影响。结果转染重组腺病毒Ad - STAT3 siRNA后,胶质瘤干细胞的STAT3的mRNA表达率为(41.5±7.3)％,蛋白表达率为（31.2±6.4）％,细胞的增殖受到抑制,凋亡率为(23.8±6.1)％,同时荷瘤裸鼠的肿瘤生长受到抑制,生存期延长。结论重组腺病毒介导的STAT3 RNAi可显著抑制靶基因的表达与活化,显著抑制胶质瘤干细胞的生长功能,为基于胶质瘤干细胞的功能治疗提供了基础理论。     

人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的：构建人白细胞介素12（Human interleukin-12, hIL-12）5型腺病毒载体（Ad hIL-12）,感染人骨髓间充质干细胞（Human bone-marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）,检测IL-12的表达,为IL-12临床应用方式的改进奠定基础。 方法：实验于2009-05/2009-12在解放军北京军区总医院生物治疗中心实验室完成。人树突状细胞（Dendritic cells, DCs）经细菌脂多糖（LPS）处理24 h后提取DCs总RNA,用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA,分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)和pmRNA IRES中;然后再亚克隆至腺病毒载体穿梭质粒pDC515,p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点（Internal ribosomal entry sites, IRES）连接,构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒。采用Ad MaxTM腺病毒载体体系,pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrtE1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12。常规培养hBMSCs,第三代hBMSCs按每孔5105细胞接种至12孔板中,Ad hIL-12按每个细胞100 pfu的感染复数（MOI）感染hBMSCs 2 h后经10 Gy 射线照射使hBMSCs失去增殖能力,每24 h更换一次培养液,收集1-5天的细胞培养上清,用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中hIL-12的含量。 结果：经测序证实,RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882（762 bp）和NM_002187（987 bp）提供的序列完全一致。pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞约10天左右细胞开始有空斑（plagues）形成,挑取明显的空斑接种至293细胞,经过2-3轮扩增后,收集293细胞冻溶裂解,提取DNA进行PCR鉴定,分别获得hIL-12 p40和p35 PCR片段,证实冻溶裂解物中含有hIL-12 p40和p35基因DNA片段。纯化的病毒按100 pfu/细胞的MOIs感染hBMSCs,ELISA检测12 h即有IL-12的分泌,至24-48 h表达量到达高峰,并持续表达至第五天表达水平仍无下降趋势,12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h hIL-12表达量分别为(4.91±0.09) 、(59.40±1.17) 、(106.88±1.64) 、(144.53±3.10)、(182.72±0.14)和(205.83±0.14) ng/106细胞/24 h。 结论：用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白;Ad hIL-12腺病毒载体感染hBMSCs后可持续高水平分泌hIL-12,在以hBMSCs为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景。     

慢病毒介导的RNAi下调miR-221抑制U87胶质瘤细胞生长的研究

目的 探讨下调miR-221对U87胶质瘤细胞生长的影响及可能的作用机制.方法 构建靶向miR-221的siRNA慢病毒表达载体并感染U87胶质瘤细胞,应用原位杂交、定量PCR和Western blot法检测干扰后细胞内miR-221及p27蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化,Transwell法检测细胞侵袭力改变.结果 成功构建了靶向miR221的siRNA慢病毒表达载体,该载体能有效抑制内源性miR-221的表达,同时上调p27蛋白的表达,同时抑制细胞生长,诱导凋亡,降低细胞的侵袭力.结论 成功构建靶向miR-221的RNAi慢病毒表达载体,该载体能够有效抑制miR-221的表达并抑制U87胶质瘤细胞的生长,为以miR-221为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础.     

RNA干扰技术联合抑制AKT1和COX-2表达对U251胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞株AKT1和COX-2表达后,在体外对U251细胞增殖的抑制作用.方法 构建靶向AKT1和COX-2的RNAi重组腺病毒表达载体(rAd-A+C)转染至U251细胞.应用Realtime PCR检测AKT1和COX-2 mRNA水平的变化;应用Western blot检测AKT1和COX-2蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用MTr法和流式细胞术评价肿瘤细胞的增殖活性.结果 rAd-A+C可显著抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达;与对照组和无义序列处理组(rAd-HK)比较,Western blot分析结果显示下游相关因子PCNA、Cyclin D1表达下降,而p53表达上调;细胞周期分析结果表明rAd-A+C处理组进入S期的细胞数较对照组减少了7.0%～7.8%,出现G0/G1期阻滞;MTT法分析显示rAd-A+C处理组细胞生长抑制率＞58%.结论 靶向AKT1和COX-2的RNAi技术可显著抑制U251细胞AKT1和COX-2表达,在体外对U251细胞增殖活性产生明显抑制作用.因此,RNAi重组腺病毒表达载体介导的基因治疗可成为胶质瘤靶向治疗的新策略.     

缺血后处理对SH-SY5Y细胞缺血再灌注模型的保护作用

目的研究缺血后处理对SH-SY5Y细胞缺血再灌注损伤模型的保护作用,并初步探讨其作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为三组：正常组、缺血再灌注组、缺血后处理组,缺血再灌注组予以糖氧剥夺12 h后正常培养,缺血后处理组经糖氧剥夺12 h后予以3个循环的正常培养10 min/糖氧剥夺10 min,正常培养12 h后通过光镜、荧光显微镜以及细胞计数法、流式细胞术、SOD活力检测SH-SY5Y细胞的改变。结果缺血后处理组的SH-SY5Y细胞存活率较缺血再灌注组明显增加而凋亡率明显下降（P〈0.01）,经缺血后处理的SH-SY5Y细胞内SOD的活力较缺血再灌注组增加32.53%（P〈0.05）。结论缺血后处理在细胞离体状态下可以发挥保护作用,能够降低SH-SY5Y细胞缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡,提高细胞内SOD的活力。     

靶向PTTG1基因的微小RNA转染后诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的研究

目的 构建表达靶向抑制垂体瘤转化基因1 (PTTG1)基因表达的RNA干扰载体microRNA,导入人脑胶质瘤细胞株U251中,研究靶向抑制PTTG1基因对U251细胞的凋亡诱导作用.方法 以PTG1为靶基因,根据pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体要求,设计针对PTIG1的microRNA序列,脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,采用荧光定量多聚酶链反应(PCR)以及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;膜联蛋白Ⅴ与碘化丙啶(annexinⅤ/PI)双色标记的流式细胞仪法检测microRNA诱导的细胞凋亡,碘化丙锭(PI)染色检测细胞周期阻滞.结果 实时荧光定量PCR以及Western blot检测显示,PTTG1基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;转染后,流式细胞仪检测分析显示,PTTG1基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论 靶向PTTG1基因的重组microRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PTTG1介导的RNAi显著靶向抑制了PTTG1基因在人脑胶质瘤细胞中的表达,并明显地诱导了脑胶质瘤细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

腺病毒介导嗜铬瘤细胞中p75神经营养因子的RNA干扰

课题前期研究发现,在急性马尾神经受压模型大鼠中,马尾神经元华勒氏变性和腰骶脊髓前角运动神经元的凋亡及马尾相应阶段脊髓中有p75NTR的高表达存在正向变化关系。本文设想用腺病毒携带shRNA的方式,进行针对p75NTR基因沉默病毒的包装及体外验证重组腺病毒的基因沉默效果。实验按照Reynolds siRNA模板寡核苷酸的设计原则,设计合成3条p75 siRNA模板寡核苷酸片段（shRNA）,随后分别克隆进Shuttle vector 1.0 CMV,与表达加强绿色荧光蛋白的腺病毒载体骨架共转染HEK293细胞成功包装出具有p75shRNA的腺病毒,所得病毒分别命名为Ad.shRNA1、Ad.shRNA2、Ad.shRNA3,重组腺病毒分别感染体外培养的PC12细胞。48h后收集PC12细胞中p75NTRmRNA及总蛋白,发现相对于阴性对照,在mRNA水平,Ad.shRNA1,Ad.shRNA2,Ad.shRNA3组RNA干扰率为分别为（98.49±0.68）％,（95.08±1.79）％,（96.60±1.14）％;在蛋白水平,其RNA干扰率分别为（72.89±2.17）％,（58.83±1.15）％,（59.88±0.44）％。由此得出重组腺病毒成功的抑制了p75NTR的表达,其中以Ad.shRNA1基因沉默效果最为显著。     

IL-10基因转染对大鼠脑缺血再灌注损伤半影区钠氢交换器-1基因表达的影响

目的 观察SA脂质体介导入白介素-10(hIL-10)基因转染对脑缺血再灌注损伤模型大鼠半影区钠氢交换器-1(NHE-1)基因表达的影响,探讨IL-10缺血脑保护的作用机制.方法 成年雄性SD大鼠78只按随机数字表法分为正常对照组(6只)、缺血对照组(24只)、hIL-10基因转染组(24只)、空质粒组(24只).采用Longa法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型.正常对照组不做任何操作;缺血对照组仅做大脑巾动脉阻塞(MCAO)模型和立体定向操作,不注射任何药物;hIL-10基因转染组和空质粒组在建立MCAO模型后,采用立体定向方式分别将SA脂质体/pcDNA3.1-hIL-10混合物或SA脂质体/pcDNA3.1混合物注射入大鼠侧脑室内.24、72、168 h分别用RT-PCR和ELISA检测其转染效果,TTC染色测定脑梗死体积,采用荧光实时定量PCR技术观察各组大鼠脑组织中NHE-1 mRNA和核转录因子NF-κB mRNA的表达水平.结果 (1)RT-PCR结果 :hIL-10基因转染组人鼠在缺血再灌注72 h时,其皮层和海马中均能检测到hIL-10mRNA的表达,而正常对照组、缺血对照组和空质粒组中则不能检测剑hIL-10 mRNA.ELISA结果 :基因转染后24 h(764.63±87.88)脑组织中hIL-10蛋白与正常对照组(81.23±8.61)比较明显升高,72h(1310.21±86.19)较24h更高,但到168 h(541.32±80.77)时已明显下降,但仍高于缺血对照组和空质粒组差异均有统计学意义(P＜0.05).同时hlL-10基因转染组大鼠脑梗死体积明显小于缺血对照组和空质粒组差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)正常对照组、缺血对照组、空质粒组和hIL-10基因转染组NF-κBmRNA的表达量分别为1.00±0.33、4.76±0.41、4.58±0.62和2.77±0.43.与正常对照组相比,其它三组NF-κB mRNA的表达量均升高,差异有统计学意义(p＜0.01).但hIL-10基因转染组的升高水平低于缺血对照组和空质粒组,差异有统计学意义(p＜0.01).(3)正常对照组、缺血对照组、空质粒组和hIL-10基囚转染组NHE-1 mRNA的表达量分别为1.00±0.22、4.16±0.48、3.97±0.51和2.82±0.47.与正常对照组相比,后三组NHE-1 mRNA的表达量均升高,差异有统计学意义(P＜0.01),其中hIL-10基因转染组的升高水平低于其它两组差异有统计学意义(P＜0.01).结论 hIL-10基因转染可能通过抑制脑缺血再灌注引起的NHE-1基因表达的增加而发挥缺血脑保护作用.     

腺病毒载体介导的RNAi对胶质瘤U251细胞肝细胞生长因子受体表达的影响

目的探讨腺病毒载体介导的RNA干扰技术对胶质瘤细胞肝细胞生长因子（HGF）受体（c—Met）的表达和细胞凋亡的影响。方法用PCR法获得人U6启动子及带有c—Met反向互补靶序列的片段HU6shmet：利用腺病毒载体将其传递至U251细胞；分别采用RT-PCR和Western blot方法检测U251细胞的c—Met mRNA和蛋白的表达．Annexin—V—PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡状况。结果获得了带有人U6启动子及c—Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了rAdUshmet1和rAdUshmet2的U251细胞的c—Met mRNA和蛋白相对表达量较未转导腺病毒及转导了rAdGFP和rAdU-sicon的U251细胞均有明显下降（P〈0．01），rAdUshmet1和rAdUshmet2转导的U251细胞凋亡率分别为（13．5±4．21％和（28．2±5．6）％，明显高于未转导腺病毒的及rAdGFP和rAdUsicon转导的U251细胞凋亡率（P〈0．05）。结论腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c—Met表达，能在一定程度上阻断HGF—c—Met信号通路，有可能成为对胶质瘤进行基因治疗的有效载体。     

Alteration of intracellular pH and activity of CA3-pyramidal cells in guinea pig hippocampal slices by inhibition of transmembrane acid extrusion

Transmembrane acid extruders, such as electroneutral operating Na(+)/H(+)-exchangers (NHE) and Na(+)-dependent Cl(-)/HCO(3)(-)-exchangers (NCHE) are essential for the maintenance and regulation of cell volume and intracellular pH (pH(i)). Both of them are hypothesised to be closely linked to the control of excitability. To get further information about the relation of neuronal pH(i) and activity of cortical neurones we investigated the effect of NHE- and/or NCHE-inhibition on (i) spontaneous action potentials and epileptiform burst-activity (induced by bicuculline-methiodide, caffeine or 4-aminopyridine) and (ii) on pH(i) of CA3-neurones. NHE-inhibition by amiloride (0.25-0.5 mM) or its more potent derivative dimethylamiloride (50 microM) and NCHE-inhibition by 4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS, 0.25-0.5 mM) induced a biphasic alteration of neuronal activity: an initial, up to 30 min lasting, increase in frequency of action potentials and bursts preceded a growing and partially reversible suppression of neuronal activity. In BCECF-loaded neurones the pH(i), however, continuously decreased during either amiloride- or DIDS-treatment and reached its steady-state (DeltapH(i) up to 0.3 pH-units) when the neuronal activity was markedly suppressed. Combined treatment with amiloride (0.5 mM) and DIDS (0.5 mM) or treatment with harmaline alone (0.25-0.5 mM), which also continuously acidified neurones via inhibition of an amiloride-insensitive NHE-subtype, induced a monophasic and partially reversible suppression of neuronal activity. As an initial excitatory period failed to occur during combined NHE/NCHE-inhibition we speculate that its occurrence during amiloride- or DIDS-treatment resulted rather from disturbances in volume- than in pH(i)-regulation. The powerful inhibitory and anticonvulsive properties of NHE- and NCHE-inhibitors, however, very likely based upon intracellular acidification - as derived from our previous findings that a moderate increase in intracellular free protons is sufficient to reduce membrane excitability of CA3-neurones.     

腺病毒介导Nogo受体特异性RNA干扰对大鼠脑缺血再灌注后轴突再生和神经行为的影响

目的 观察腺病毒介导Nogo受体特异性RNA干扰对大鼠脑缺血再灌注后轴突再生及神经行为的影响.方法 采用线栓法制作大鼠缺血再灌注模型,20只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组和RNAi干预组、阴性对照组.术后24 h、9周行CT测量腩梗死体积,术后行神经功能评分,示踪技术观察皮质红核束和皮质脊髓束.结果 RNAi治疗后脑梗死体积较缺血再灌注组和阴性对照组没有明显变化(P＞0.05),而RNAi治疗3周后,神经功能有明显地恢复(P＜0.01),RNAi治疗9周后健侧皮质红核束发出侧枝支配病灶侧的数量明显增多(P＜0.01).结论 腺病毒介导NgR特异性RNAi可以增加来源于健侧皮质的轴突侧枝出芽,从而促进神经功能的恢复.     

Effects of the NHE-1 inhibitor cariporide alone or together with the P2Y12 antagonist AR-C 69331 MX on CD62p expression and formation of platelet-leukocyte aggregates

The sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) contributes to platelet activation at elevated pH. Effects of NHE-1 inhibitors on platelet degranulation and formation of proinflammatory and procoagulatory platelet-leukocyte aggregates (PLA) and possible interactions with P2Y(12) inhibitors--which also affect platelet degranulation--have not been investigated. Whole blood from healthy human subjects was incubated with the NHE-1 inhibitor cariporide and the P2Y(12) inhibitor AR-C 69331 MX at clinically reasonable concentrations, in the presence of normal pH or in a propionate model to activate the NHE-1 (approximately pH 7.0). The degranulation marker CD62p, the expression of the activated GPIIb/IIIa receptor (PAC-1), and formation of platelet-leukocyte (monocyte) aggregates (PLA) was assessed by flow cytometry. Cariporide at concentrations up to 20 microg/ml had no effects on ADP- (5 microM) or TRAP- (2 microM) induced CD62p expression or PLA formation at normal pH. At pH 7.0 and stimulation with ADP, PLA decreased from 64+/-24% (control) to 47+/-23% under cariporide at 2 microg/ml (p<0.05), and the MFI of PLA (i.e. the platelet mass attached at monocytes) decreased from 547+/-203 to 360+/-96 units (p<0.05). PAC-1 MFI decreased from 66+/-23 to 34+/-18 units (p<0.05) after ADP and from 74+/-29 to 42+/-17 units (p<0.05) after TRAP, respectively. AR-C 69331 MX (10 nM) had inhibitory effects on all parameters irrespectively of the pH, and the combination of both agents at pH 7.0 shows additive effects. In conclusion, our investigation points to-perhaps clinically relevant-effects of NHE-1 inhibition on the degranulation of platelets and formation of platelet-leukocyte aggregates.     

人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA（shRNA）表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应（PCR）和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。     

RNA干扰联合抑制PI3KP85和AKT1表达对U251胶质瘤细胞侵袭的影响

目的 探讨应用RNA干涉(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞丝/苏氨酸蛋向激酶1(AKT1)和3-羧基磷脂酰肌醇激酶的85000催化亚基(P13KP85)表达后对U251胶质瘤细胞侵袭的抑制作用.方法 实验设正常对照组(未做任何处理);阴性对照组(rAd-HK组):用无义序列重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞;基凶治疗组(rAd-A+P组):用靶向AKT1和P13KP85的重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞.应用实时PCR检测AKT1和P13KP85 mRNA水平的变化;应用Western blot方法 检测AKT1和P13KP85蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞外基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)浓度的变化;应用划痕和Transwell实验评价肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果tAd-A+P 可显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和P13KP85的表达.与正常对照组和rAd-HK组比较.rAd-A+P组MMP2、MMP9表达下降,而基质金属蛋白酶抑制因子(TMP2)表达上调,差异有统计学意义(P<0.05).划痕和Transwell实验显示rAd-A+P组细胞体外侵袭能力明显减弱.结论 靶向AKT1和P13KP85的RNAi技术可以显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和PDKP85表达,对U251胶质瘤细胞的侵袭能力产生明显抑制作用.