恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒ＤＮＡ直接免疫接种诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫ＤＮＡ疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＰＣＲ法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ、Ｔ淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用ＰＣＲ法从上述组织中均检测到ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达１２５６０，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８直接免疫接种，能特异性地剌激ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

恶性疟原虫Pf12基因重组质粒DNA接种诱导小鼠的免疫应答

目的　观察重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠所产生的免疫应答 ,分析Pf12基因的抗原性和作为疫苗抗原候选分子的可能性。方法　构建重组质粒VR10 12 -Pf12 ,直接免疫BALB/c小鼠 ,通过NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平、ELISA、体外抑虫试验测定 ,观察其诱导的细胞和体液应答以及体外抑虫效果。结果　重组质粒VR10 12 -Pf12免疫BALB/c小鼠 ,NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平明显高于对照组 (P <0 0 1) ,诱导小鼠产生的抗体水平明显增高 (P <0 0 1) ,免疫血清在体外能抑制恶性疟原虫的生长、发育。结论　重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠产生一定水平的体液和细胞免疫应答 ,其免疫血清在体外对恶性疟原虫的生长、发育有明显的抑制作用。     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的　探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法　用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果　重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论　HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 ,HRP2重组蛋白疫苗具有潜在的应用前景     

恶性疟原虫复合抗原基因PcDNA3—Pf8的免疫血清对恶性疟原虫FCC—1/HN株体外生长发育的影响

观察肌肉接种编码恶性疟原虫复合多价保护性抗原的重组质粒pCDNA3—Pfs诱导小鼠产生的免疫血清对体外培养恶性疟原虫的抑制作用。方法将pCDNA3—Pfs通过肌肉途径免疫接种BALB／c小鼠,3次免疫后制备抗血清．进行酶联免疫吸附试验和疟原虫体外生长抑制试验。结果血清特异抗体滴度达1：2560,体外抑制试验示随培养物中免疫血清浓度的增加及孵育时间的延长而抑制程度增强,l：5稀释作用于原虫72h后,抑制率可达68．7％。结论直接肌肉接种质粒pCDNA3—Pj’8可诱导BALB／C小鼠产生良好的免疫反应及明显的抑制原虫体外生长发育的作用。     

恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答

目的 观察用恶性疟原虫复合抗原基因HGFSP构建的DNA疫苗pc-HGFSP免疫小鼠诱导的细胞及体液免疫应答。方法 用pc-HGFSP肌注免疫C57BL／6小鼠并加强免疫2次，取小鼠脾淋巴细胞及血清测定；脾淋巴细胞增殖活性（MTT）法，NK细胞活性和CTL活性（LDH）；脾脏CD4^ 及CD8^ T细胞亚群（免疫荧光法）：血清pc-HGFSP批原特异性抗体（ELISA法）及一氧化氮（NO）含量。结果 与pcDNA3对照比较，pc-HGFSP免疫小鼠脾淋巴细胞增殖活性增高24％－37％；NK细胞活性增高38％－90％；CTL活性增高65％－153％；CD8^ T细胞亚群增加。免疫血清产生HGFSP抗原特异性IgG抗体；NO含量也有所增高。结论 恶性疟DNA疫 pc-HGFSP有一定的诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答的作用。     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的　观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法　将旋毛虫肌幼虫编码 31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠 ,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测 ,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Westernblot分析。结果　IFAT表明 pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应 ,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光。Westernblot检测结果显示 ,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的 31kDa抗原组分 ,而 pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应。结论　旋毛虫DNA疫苗 pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

重组表达的恶性疟原虫顶端膜抗原1片段诱导小鼠保护性抗体应答

目的分析恶性疟原虫顶端膜抗原(apicalmembraneantigen1,AMA1)主要结构域在诱导保护性抗体应答中的作用,为正确选择疫苗应用片段提供依据。方法PCR扩增编码P.fAMA1相应结构域的基因序列,构建pET原核表达载体,用纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定抗体效价,用免疫荧光和免疫印迹分析抗体的特异性,用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验。结果成功表达并纯化了代表AMA1不同结构域的重组抗原片段,包括完整的胞外域片段E、结构域Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,免疫小鼠后分别诱导出不同滴度的IgG抗体,免疫血清可特异地识别天然AMA1抗原,重组蛋白E和Ⅰ+Ⅱ免疫血清可明显抑制疟原虫的体外生长。结论AMA1胞外结构域的完整性是构成保护性抗体表位的重要基础,保护性抗体表位主要分布在结构域Ⅰ中。     

恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT免疫原性及免疫保护作用的研究

目的 探讨在毕赤酵母中表达的恶性疟原虫重组蛋白次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGXPRT）诱导小鼠产生的免疫原性和免疫保护作用。 方法 35只BALB/c小鼠随机分为HGXPRT+ISA720实验组、HGXPRT+福氏佐剂试验组、ISA720对照组、福氏佐剂对照组和空白对照组等5组。HGXPRT（50 μg/200 μl）经小鼠后腿皮下免疫3次，间隔3周。每次免疫后2周尾静脉采血，ELISA检测血清特异性抗体水平。以间接免疫荧光试验（IFAT）分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况。于末次免疫后10 d，各组小鼠经腹腔攻击感染约氏疟原虫致死株10⁵个，继而每隔1 d采尾血制薄血片，观察原虫感染的动态变化。 结果 重组蛋白HGXPRT经与佐剂乳化后免疫的小鼠均诱导出针对HGXPRT的体液免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达到1∶10⁵以上，而两佐剂组和空白对照组小鼠均未产生特异性抗体。经HGXPRT诱导血清能识别恶性疟原虫天然HGXPRT抗原。经约氏疟原虫致死株攻击感染后4 d，两佐剂对照组和空白对照组疟原虫感染高峰相比实验组提前1 d。HGXPRT+ISA720实验组平均原虫率（29.3%）明显低于ISA720对照组（70.0%）和空白对照组（70.0%）（P<0.05）；HGXPRT+福氏佐剂实验组平均原虫率（51.0%）亦明显低于福氏佐剂对照组（60.7%）与空白对照组（70.0%）（P<0.05）。 结论 恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT对小鼠有较强的免疫原性，产生的抗体能识别恶性疟原虫HGXPRT天然蛋白，并对疟原虫攻击感染后的小鼠有一定免疫保护作用。     

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体, 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）, 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达, 将纯化的表达产物免疫接种小鼠, 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定, 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带;表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加, 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答, 并提高小鼠ＮＫ细胞活性的作用     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。其有可能作为恶性疟原虫红内期复合DNA疫苗的候选基因     

弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的观察弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用. 方法重组质粒pBK-P30用生理盐水稀释后,肌注免疫BALB/c小鼠.分别于免疫后5周和10周,ELISA测定IgG抗体滴度;取免疫鼠的血液、肺、心脏、肝脏、脾、肾脏及肌肉PCR扩增P30基因;免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染.结果两次检测,均可测到特异性IgG抗体,且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高;免疫后5周,免疫鼠的上述组织均可扩增出P30基因条带,但免疫后10周仅血液扩增出特异P30基因条带;弓形虫速殖子腹腔攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较对照组鼠延长,但统计学差异不显著(P＞0.05). 结论弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用.     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒, 直接免疫小鼠, 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒, 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠, 每鼠注射１００ μｇ,２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次, 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性; 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目;ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后, 脾脏明显增大; 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群, ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化, 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果, 与对照组相比较, 无明显增高; 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高, 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠, 可诱导产生细胞及体液免疫应答。     

恶性疟原虫MSP1_(19)与PfCMR基因的体外重组与克隆鉴定

目的：构建编码恶性疟原虫复合多价保护性抗原的基因的重组质粒,为进行基因免疫提供条件。方法：设计一对特异引物Ｐ１与Ｐ２,采用ＰＣＲ法扩增获取ＭＳＰ１中Ｃ端１９肽基因,纯化后用ＳａｌⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切,把含复合基因ＰｆＣＭＲ的重组质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ双酶切,回收复合基因ＰｆＣＭＲ,将ＭＳＰ１１９基因与ＰｆＣＭＲ基因串联后与经ＥｃｏＲⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３进行重组,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,经电泳初筛、双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ的ＭＳＰ１１９基因,重组克隆经双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定后获得正确重组克隆子ｐｃＤＮＡ３－ＰｆＣＭＲ－ＭＳＰ１１９（命名为ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８）,Ｐｆ８基因长度为６１８ｂｐ。结论：成功构建编码恶性疟原虫多价保护性抗原的基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８。     

细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗体外瞬时表达及对小鼠诱导的免疫应答

目的　检测细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗(pcDNA3 Eg95)体外瞬时表达,探讨其诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。　方法　pcDNA3 Eg95经脂质体转染HeLa细胞瞬时表达。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Eg95抗原信使RNA(mRNA)在HeLa细胞中的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(Westernblot ting)检测Eg95蛋白的瞬时表达情况。pcDNA3 Eg95基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测IgG和IgG2a水平,四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应。　结果　RTPCR检测结果显示,pcD NA3 Eg95瞬时表达组有Eg95抗原基因mRNA表达,ELISA和Westernblotting检测结果表明,可在HeLa细胞中特异性表达Eg95蛋白。用pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫BALB/c小鼠,第3周出现特异性IgG免疫应答,持续升高至第10周,显著高于对照组。从第2周开始,小鼠血清IgG2a应答即为阳性,且长时间(至第10周 )维持较高水平,与pcD NA3空质粒组比较,其差异具有非常显著性意义(P<0.01)。用原核表达的Eg95重组蛋白刺激免疫小鼠脾细胞,有明显的T细胞增殖反应。pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫组刺激指数明显高于pcDNA3空质粒组(P<0.01)。结论　pcDNA3 Eg95基因疫苗可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细     

周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因真核表达载体的构建及DNA免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)真核表达载体pcDNA3.1-BmGAPDH,并观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR方法扩增目的 基因片段.与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆.经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3-BmGAPDH表达载体,将纯化的pcDNA3.1-BmGAPDH和CpG经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次免疫间隔2周.用RT-PCR方法检测肌肉组织内目的 基因;用噻唑蓝(MTT)法、ELISA方法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子IFN-γ、IL-4水平.应用SPSS统计学软件进行样本均数的t检验.结果 成功构建了pcDNA3.1-BmGAPDH真核表达载体,基因片段全长为1020 bp.DNA序列分析与基因库已知基因序列同源性为99%.该真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织扩增出目的 基因重组质粒组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数显著高于PBS对照组及空质粒对照组,淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.398、1. 006和1.017(P<0.05).重组质粒组IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于PBS对照组及空质粒对照组,分别为163.905、58.589、51.317 ng/L和107.906、27.111、34.627 ng/L(P<0.05).免疫佐剂CpG与疫苗同时注射可增强机体的免疫应答,表现为IFN-γ水平和免疫4周后淋巴细胞刺激增殖指数显著上升.结论 pcDNA3.1-BmGAPDH真核表达载体能在小鼠体内表达并可诱导相关的细胞免疫应答.