弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的 克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法 诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。 结果 从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690 bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4％,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6％（P＜0.05）。 结论 原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。     

弓形虫PRU株慢性感染小鼠脑部包囊的时空分布特征

目的观察实验小鼠脑内包囊的时空分布特点,为探讨弓形虫感染引起的情志和行为改变提供病理基础。方法弓形虫PRU株经口感染小鼠,经HE染色和免疫组化检测,在显微镜下计算前额、海马、丘脑、小脑和杏仁核部位的包囊个数,然后随机选取上述部位的5个视野拍照,计算包囊的平均密度,并用方差分析比较不同脑组织包囊密度有无统计学差异。结果弓形虫感染30和90d时,HE染色和免疫组化后显微镜观察发现,小鼠不同位置弓形虫包囊密度差异有统计学意义,其中,丘脑的包囊密度最大,其次是前额皮质、海马、杏仁核,小脑的包囊密度最小。丘脑的包囊密度显著高于其他4个脑区（P〈0.01）,小脑的包囊密度显著低于其它4个部位（P〈0.01）,而前额皮质、海马和杏仁核所含的包囊密度差异无统计学意义（P〉0.05）;弓形虫感染1个月时,杏仁核包囊密度明显低于感染3个月（F=18.314,P〈0.001）,但是小脑的包囊密度高于感染3个月（F=18.314,P〈0.001）。结论弓形虫包囊在慢性感染小鼠不同脑组织内的分布具有时空特异性,这可能是其临床表现的病理学基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

弓形虫PRU株慢性感染小鼠脑部包囊的时空分布特征

目的 观察实验小鼠脑内包囊的时空分布特点,为探讨弓形虫感染引起的情志和行为改变提供病理基础.方法 弓形虫PRU株经口感染小鼠,经HE染色和免疫组化检测,在显微镜下计算前额、海马、丘脑、小脑和杏仁核部位的包囊个数,然后随机选取上述部位的5个视野拍照,计算包囊的平均密度,并用方差分析比较不同脑组织包囊密度有无统计学差异.结果 弓形虫感染30和90 d时,HE染色和免疫组化后显微镜观察发现,小鼠不同位置弓形虫包囊密度差异有统计学意义,其中,丘脑的包囊密度最大,其次是前额皮质、海马、杏仁核,小脑的包囊密度最小.丘脑的包囊密度显著高于其他4个脑区(P＜0.01),小脑的包囊密度显著低于其它4个部位(P＜0.01),而前额皮质、海马和杏仁核所含的包囊密度差异无统计学意义(P＞0.05);弓形虫感染1个月时,杏仁核包囊密度明显低于感染3个月(F=18.314,P＜0.001),但是小脑的包囊密度高于感染3个月(F=18.314,P＜0.001).结论 弓形虫包囊在慢性感染小鼠不同脑组织内的分布具有时空特异性,这可能是其临床表现的病理学基础.     

佛山市顺德区2008~2013年儿童青少年肺结核疫情分析

目的 分析2008～2013年间顺德区0～24岁儿童青少年肺结核报告发病特征,探讨该人群结核病流行情况,为制定有效的防控措施提供科学依据.方法 采用描述性流行病学方法对2008～2013年顺德区结核病管理信息系统报告的0～24岁儿童青少年肺结核患者患病情况进行分析.结果 2008～ 2013年顺德区共报告0～24岁儿童青少年肺结核2024例,其中学生患者所占比例最大（28.46％）,年龄主要集中在20～24岁,男性明显多于女性;春季发病较多,冬季较少.结论 顺德区儿童青少年肺结核的疫情形势较严峻,肺结核病预防控制工作任重而道远,尤其要加强学生的结核病防控工作.     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

广州及其周边地区福寿螺体内广州管圆线虫感染的现状调查

目的了解广州及其周边地区福寿螺感染广州管圆线虫的情况，为防治提供依据。方法．人式消化174只福寿螺。显微镜下检查消化液中有无广州管圆线虫幼虫。结果广东省广州市花都区、广州市越秀区、兴宁、化州、蕉岭、茂名等六地的福寿螺感染率分别为25．0％、23．1％、24．2％、18．5％、14．3％、13．3％，广东省东莞采集的福寿螺未发现感染广州管圆线虫。结论广东省广州市花都区、广州市越秀区、兴宁、化州、蕉岭、茂名等六地存在广州管圆线虫的自然疫源地。     

弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫免疫检测中的应用

目的评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景。方法以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓形虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板,分别检测弓形虫急性和慢性感染血清,评价试剂盒检测的敏感性和特异性。结果经Ni-NTAAgarose和割胶纯化,得到了纯度为95.86%的弓形虫多表位重组可溶性抗原。以3!g/ml的抗原浓度包被ELISA微孔板,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测。结果检测小鼠血清141份,其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%。检测兔血清24份,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%,总一致性为91.5%。结论以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景。     

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析

目的 克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法 提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665 bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60 kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83 kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论 成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。