结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M.tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因，并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21（DE3）菌后，经0．4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得PPE68重组蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌RD1区rv3873基因的原核表达及其产物的细胞免疫特性初步分析

目的克隆表达结核分枝杆菌RD1区Rv3873蛋白并初步分析其细胞免疫特性。方法应用PCR技术扩增rv3873基因,插入表达载体pET30a(+),构建原核表达重组质粒pET-Rv3873,重组质粒在宿主菌BL21(DE3)诱导表达,利用表达的蛋白腹腔注射免疫小鼠,以细胞增殖和ELISPOT试验测定融合蛋白的细胞免疫应答。结果克隆的rv3873测序与已发表序列100%同源,融合蛋白大小43ku,淋巴细胞增殖实验显示该蛋白能引起小鼠T细胞免疫反应,ELISPOT实验结果表明多肽pep3873刺激特异性IFN-γ分泌细胞多于IL-4分泌细胞。结论成功地克隆表达了Rv3873蛋白,并发现该蛋白具有良好的细胞免疫特性。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体,并进行表达,纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后,经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导,表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB,并获得GIcB重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体。然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家免,取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法,检测家兔血清中的抗体。结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。获得纯度为90％的重组蛋白。纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a（＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

丙型肝炎NSSATP6基因原核表达载体的构建和表达纯化及多克隆抗体的制备

目的构建丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式激活蛋白6基因的原核表达载体并进行表达、鉴定。方法从已构建的pGBKT7-NS5ATP6质粒上切取NS5ATP6基因，再克隆入pET32a（＋）质粒，构建pET32a（＋）-NS5ATP6表达重组体。结果以pET32a（＋）-NS5ATP6重组体分别转化DH5a和Rosseta大肠埃希菌后，经IPTG诱导，pET32a（＋）-NS5ATP6表达出分子量为41KD左右的重组蛋白。免疫动物并经Westernblot检测证实其具有良好的抗原性。结论成功地构建了原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP6，诱导表达和纯化了NS5ATP6融合蛋白，并制备了该蛋白的多克隆抗体，为下一步该基因功能研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

丙型肝炎NS5ATP6基因原核表达载体的构建和表达纯化及多克隆抗体的制备

目的构建丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式激活蛋白6基因的原核表达载体并进行表达、鉴定。方法从已构建的pGBKT7-NS5ATP6质粒上切取NS5ATP6基因,再克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP6表达重组体。结果以pET32a( )-NS5ATP6重组体分别转化DH5α和Rosseta大肠埃希菌后,经IPTG诱导,pET32a( )-NS5ATP6表达出分子量为41KD左右的重组蛋白。免疫动物并经Westernblot检测证实其具有良好的抗原性。结论成功地构建了原核表达载体pET32a( )-NS5ATP6,诱导表达和纯化了NS5ATP6融合蛋白,并制备了该蛋白的多克隆抗体,为下一步该基因功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌LprG基因的克隆、表达

目的构建结核分枝杆菌LprG基因的融合表达载体,在大肠杆菌中进行表达,为研究其在结核病诊断中的作用奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出LprG基因,克隆到pEASY T1中,序列测定正确后,再亚克隆到融合表达载体PET28a(+)中,转化入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果获得结核分枝杆菌LprG蛋白,凝胶薄层扫描分析表达量在38%左右,主要以可溶性形式存在。结论获得了重组结核分枝杆菌LprG蛋白,为以后研究奠定了基础。     

GFP-Rv2626c融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的构建含Rv2626c基因的原核表达载体,获得GFP-Rv2626c融合蛋白,为今后开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下基础。方法以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR法扩增得到Rv2626c基因DNA片段。将扩增片段克隆到pGM-T载体中测序,并进一步将Rv2626c亚克隆到pET28a-GFP中,构建原核重组表达载体pET28a-GFP-Rv2626c。将pET28a-GFP-Rv2626c转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导目的基因表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析和纯化该表达产物。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pET28a-GFP-Rv2626c。用IPTG诱导该质粒转化的E.coliBL21后,获得分子量约46kD的GFP-Rv2626c融合蛋白。经Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-Rv2626c融合蛋白。结论成功制备出重组GFP-Rv2626c融合蛋白,为开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下了基础。     

肺炎支原体P30蛋白结构基因的克隆和表达研究

目的构建完整的肺炎支原体粘附分子P30蛋白结构基因原核表达质粒并进行表达。方法用引物修饰法将P30基因中唯一的“UGA”码突变为“UGG”,PCR扩增出P30蛋白编码基因后定向克隆入PET32a(+)质粒,构建PET32a(+)/P30重组体,再转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达外源基因。结果成功扩增出不含“UGA”码的P30基因;经双向测序结果与GenBank注录的P30基因序列一致;SDS-PAGE显示P30基因在BL21中得到完整表达。结论获得含有完整P30基因的重组克隆株并在大肠杆菌中表达了完整的重组蛋白,为进一步探讨P30基因及其编码产物功能打下了基础。     

结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因克隆以及表达

目的克隆结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对Hsp16.3的基因进行扩增,以pET30a为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的Hsp16.3重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。