RNAi抑制人大肠癌LOVO细胞Bmi-1基因的表达

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bmi-1基因表达对人大肠癌细胞株LOVO增殖和侵袭力的影响及机制。方法将化学法合成的针对Bmi-1mRNA不同位点设计的3对siRNA序列（siR-NA1～3）和1对带有荧光标记的FAM-siRNA（siRNA4）转染至人大肠癌LOVO细胞,荧光显微镜下观察siRNA的转染效率,QRT-PCR检测Bmi-1mRNA表达抑制作用,Western Blot检测Bmi-1蛋白表达变化,MTT法检测LOVO细胞体外增殖变化,小室侵袭实验检测LOVO细胞侵袭能力。结果利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达70%。siRNA1对mRNA表达抑制率最高,从而筛选出沉默效应最强的siRNA序列为siRNA1。siRNA1转染组LOVO细胞Bmi-1蛋白表达,增殖及侵袭力明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0.05）。结论化学合成的靶向Bmi-1siRNA转染人大肠癌LOVO细胞能有效抑制Bmi-1的mRNA和蛋白质表达水平,Bmi-1基因的RNA干扰可有效抑制人大肠癌LOVO细胞的增殖和侵袭能力。     

腺病毒过表达及siRNA干扰人肝癌HepG2细胞对11β-羟基类固醇脱氢酶I表达的影响

［摘要］　目的　观察腺病毒（Ad-11β-HSD1）过表达系统及特异性siRNA（siRNA-11β-HSD1）干扰人肝癌HepG2细胞对11β-羟基类固醇脱氢酶I（11β-HSD1）表达的影响。方法　应用Ad-11β-HSD1以及siRNA-11β-HSD1转染人肝癌HepG2细胞,用实时荧光定量PCR及Western Blot检测11β-HSD1表达。结果　转染72 h后,对照组及腺病毒过表达组细胞中均可见明显GFP荧光,且转染48 h后蛋白水平明显升高;siRNA干扰48 h后,mRNA及蛋白水平均明显降低。结论　腺病毒转染可有效过表达11β-HSD1,而siRNA干扰可有效抑制11β-HSD1表达。     

MT2-MMP基因沉默对缺氧条件下培养的胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的 利用特异性siRNA沉默人胰腺癌AsPC-1细胞的膜型金属蛋白酶2（MT2-MMP）基因表达,观察其对缺氧条件下培养的细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响.方法 采用脂质体转染法将插入MT2-MMP特异性siRNA的真核表达质粒转染至人胰腺癌AsPC-1细胞株（siRNA组）,以转染过表达MT2-MMP质粒（过表达组）或阴性对照质粒（空载体组）的AsPC-1作为对照.实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的MT2-MMP mRNA和蛋白的表达.在缺氧条件（37℃、1％O2、5％ CO2、饱和湿度的三气培养箱）下培养后,应用CCK-8法检测转染细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Transwells小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功获取MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞株和过表达的细胞株.缺氧条件下培养24h后,空载体组、过表达组、siRNA组细胞增殖的吸光度值（A490值）分别为0.68±0.08、0.80 ±0.08、0.52±0.07;细胞凋亡率分别为（6.2±1.5）％、（2.8±1.1）％、（21.4±3.9）％;每个视野（200倍）的穿膜细胞数分别为（115.8 ±23.2）、（256.4±38.6）、（45.8±18.2）个.siRNA组较空载体组的细胞增殖显著被抑制,穿膜细胞数显著减少,而细胞凋亡率显著增加（P值均＜0.05）.过表达组较空载体组的细胞增殖显著增强,穿膜细胞数显著增加,而细胞凋亡率显著降低（P值均＜0.05）.结论 MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞在缺氧条件下培养后细胞凋亡增加,增殖被抑制,侵袭力减弱.     

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3;选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞;实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率;G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001);TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

氧葡萄糖剥夺-再恢复小鼠小胶质细胞的激活及Toll样受体9表达的变化

目的观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)对小鼠BV-2小胶质细胞的激活以及Toll样受体9(TLR9)表达的影响。方法采用OGDR法建立BV-2细胞缺氧、缺糖模型,以常氧培养的BV-2细胞作为对照。使用倒置相差显微镜观察BV-2细胞在OGDR后0、6、12、24、48、72 h形态的变化,CCK8法检测OGDR后不同时间点细胞存活率的变化,反转录PCR和Western Blot检测细胞内TLR9 mRNA和蛋白的表达。结果①OGDR后BV-2细胞由原来静止的分枝状变成激活的阿米巴状。②OGDR后,细胞存活率明显下降,0 h为对照组的(65.7±9.2)%;12 h下降至最低,为对照组的(44.8±2.3)%,后逐渐升高,48、72 h分别为对照组的(60.8±10.2)%、(72.3±10.0)%。③OGDR后,随着时间的延长,TLR9 mRNA表达逐渐升高,24 h达高峰,后逐渐降低,但72 h仍高于0 h时间点的表达。TLR9蛋白表达亦呈升高趋势,在72 h达高峰。对照组各时间点TLR9 mRNA、TLR9蛋白表达差异均无统计学意义。④相同时间点的比较,OGDR组OGDR后6～72 h,TLR9 mRNA表达均明显高于对照组(P<0.05,或P<0.01,);12～72 h,TLR9蛋白表达显著高于对照组(P<0.05,或P<0.01)。结论 OGDR后BV-2细胞被激活,其细胞内TLR9表达随着时间的延长逐渐增高,可能在脑缺血-再灌注后的炎性反应中,发挥重要作用。     

siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响

背景：PcG蛋白是一组转录抑制因子,其核心成分EZH2在胃癌组织中表达增高,并与胃癌的进展相关。目的：应用RNA干扰（RNAi）技术研究EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响,从细胞水平探讨EZH2参与胃癌发生的机制。方法：使用EZH2小干扰RNA（siRNA）转染MKN45细胞,以实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测EZH2mRNA和蛋白表达,CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期．MatrigelTM侵袭实验检测细胞侵袭力。结果：EZH2siRNA能有效抑制MKN45细胞的EZH2mRNA和蛋白表达。与阴性对照siRNA组相比,EZH2siRNA组MKN45细胞增殖抑制率为14．7％（P＜0．05）,侵袭能力显著降低[穿过Transwell小室膜细胞数：（38．5±3．4）个／HPF对（92．7±9．7）个／HPF,P＜0．05）,细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。结论：EZH2siRNA可抑制人胃癌细胞的增殖和侵袭力,证实EZH2通过促进细胞增殖和侵袭在胃癌发生中发挥作用。     

shRNA干扰Rab9 GTPase表达对麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用

目的构建Rab9 GTPase短发夹RNA（shRNA）表达载体,观察其对Rab9 GTPase基因表达和麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用。方法参照GenBank中Rab9 GTPase基因序列设计合成2对Rab9 GTPase基因特异性shRNA,定向克隆人表达载体,构建重组表达载体,酶切鉴定和序列分析证实后脂质体法转染U937细胞,然后感染麻疹病毒野生株,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹技术（Western blot）检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;标准蚀斑试验测定病毒滴度;流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;RT-PCR检测转染细胞内双链RNA依赖蛋白激酶（PKR）和2′-5′寡腺甙酸合成酶（OAS-1）的mRNA水平。结果酶切和序列分析证实,成功构建了靶向Rab9 GTPase基因的shRNA表达载体。2个shRNAs均可特异性抑制U937细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,最高抑制率分别为（90.5±0.2）％和（92.1±0.3）％;蚀斑试验结果表明,shRNAs可以有效抑制麻疹病毒野生株体外增殖,其抑制率可达到90％以上;流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率无明显变化;RT-PCR检测PKR和OAs-1的mRNA水平转染前后无明显变化。结论成功构建Rab9 GTPase特异性shRNA表达载体。shRNAs通过特异性抑制Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒野生株体外增殖。     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

小干扰RNA特异性沉默CD44基因对羧甲基壳聚糖保护大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默大鼠软骨细胞的CD44基因后对细胞CD44基因表达的抑制作用及对软骨细胞在羧甲基壳聚糖(CMCS)作用下细胞生物学特性变化及其作用机制.方法 构建针对CD44基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),LipofectamineTM 2000转染软骨细胞.通过免疫荧光鉴定CD44基因特异性siRNA(CD44-siRNA)的转染情况,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法检测CD44-siRNA转染细胞中CD44基因及蛋白的表达情况;通过硝普钠诱导软骨细胞凋亡并通过流式细胞技术检测CMCS对硝普钠诱导正常及经CD44-siRNA转染软骨细胞凋亡的影响.采用单因素方差分析及SNK-q检验对结果进行统计学分析.结果 免疫荧光检测发现CD44-siRNA成功转染进入软骨细胞,转染率在60％左右.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA-1后的24、48及72 h,与空白对照组(0.429±0.053,0.501±0.037,0.341±0.009)相比,CD44的mRNA表达明显减弱(分别为0.198±0.007,0.211±0.016,0.153±0.005;q=5.93,7.01,11.23; P＜0.01).蛋白印迹法检测表明转染siRNA-1后24 h,与空白对照组相比,CD44的蛋白表达明显减弱(0.231±0.064与0.675±0.113,q=13.09,P＜0.01).流式细胞检测结果表明3 mmol/L硝普钠可以成功诱导软骨细胞发生早期凋亡[(70±6)％];50、100、200μg/ml CMCS对硝普钠诱导的凋亡有一定的抑制作用[凋亡率分别为(51±7)％,(30±4)％,(15±4)％;q=5.08,6.97,9.73;P＜0.01];但CMCS对硝普钠诱导的CD44-siRNA-1转染的软骨细胞的凋亡抑制作用比未转染组明显减弱[凋亡率分别为(34±6)％和(15±4)％,q=6.95,P＜0.01 ].结论 CD44特异性siRNA-1转染体外培养的大鼠软骨细胞能显著下调CD44基因的表达;CD44基因在CMCS保护硝普钠诱导软骨细胞凋亡中发挥重要的作用.     

BCLl1A-siRNA对HEK293细胞增殖的影响

目的设计靶向B细胞淋巴瘤／白血病11A基因的小干扰RNA（BCLllA-siRNA）,并观察其对人胚胎肾细胞株HEK293细胞增殖的影响。方法利用siRNATargetFinder工具,针对BCLllA设计合成siRNA319、siRNA585、siRNA2292、siRNA475。将HEK293细胞接种不含抗生素的培养基中,分为阳性对照组（Pc组）、阴性对照组（NC组）、BCLllA-siRNA319组（si319组）、BCLllA-siRNA585组（si585组）、BCLllA-siRNA2292组（si2292组）、BCLllA-siR-NA475组（si475组）、空转组、细胞组。通过Lipofectamine^TM2000,si319组将siRNA319、si585组将siRNA585、si2292组将siRNA2292、si475组将siRNA475分别转染HEK293细胞;转染后6h倒置荧光显微镜观察细胞转染情况并用流式细胞仪检测转染效率;转染后24、48、72h,采用实时定量RT—PCR法观察BCLllA-siRNA对BCLllA基因表达的影响;CEK8法观察HEK293细胞体外增殖情况。结果转染后24h,si585组、si2292组的HEK293细胞BCLllA基因表达降低,72h逐渐恢复;si585组、si2292组细胞增殖受抑,与NC组、空转组、细胞组相比,P均〈0．05。结论BCLlIA．siRNA585及BCLllA．siRNA2292可降低HEK293细胞中BCLllA基因表达,抑制细胞增殖。     

整合素连接激酶在重组结缔组织生长因子诱导大鼠肝星状细胞表型转化中的作用

目的研究整合素连接激酶(ILK)在重组结缔组织生长因子(rCTGF)诱导大鼠原代肝星状细胞(HSC)表型转化中的作用。方法应用胶原酶原位灌注+密度梯度离心法分离SD大鼠原代HSC,细胞贴壁培养24 h后以rCTGF处理,24 h后转染ILK小干扰RNA(siRNA)或对照siRNA,设rCTGF对照及空白对照。应用RT-PCR及Western Blot检测转染siRNA 24、48及72 h时HSCα平滑肌肌动蛋白(αSMA)、ILK及I型胶原基因表达水平变化。计量资料采用t检验。结果与空白对照相比,rCTGF处理可显著上调大鼠HSCαSMA、ILK蛋白及I型胶原mRNA表达。转染ILK siRNA可特异性抑制rCTGF诱导的ILK表达上调,与rCTGF对照相比,转染ILK siRNA 24、48及72 h时,HSC ILK蛋白表达分别下调72%±6%(t=21.39,P0.01)、87%±9%(t=68.25,P0.01)及47%±3%(t=18.25,P=0.003);αSMA蛋白及I型胶原mRNA表达分别下调5%±1%(t=2.52,P0.05)及6%±3%(t=1.63,P0.05)、31%±7%(t=34.77,P0.01)及20±5%(t=6.71,P0.05)和67%±8%(t=58.82,P0.01)及43%±6%(t=15.21,P0.01);转染对照siRNA时,HSC ILK、αSMA及I型胶原mRNA表达在相同时点无显著变化。结论 ILK可能部分介导了rCTGF诱导的大鼠HSC表型转化。     

钙非依赖型磷脂酶A2对过氧化氢诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响

目的用过氧化氢（H2O2）诱导大鼠胰岛微血管内皮细胞（IMECs）凋亡，观察钙非依赖型磷脂酶A2（iPLA2）对其凋亡的影响。方法siRNA技术抑制IMECs iPLA2表达，DNA ladder法检测H2O2诱导后的DNA片段，Annexin V—FITC／PI双染色检测细胞凋亡率，DIOCs（3）染色检测细胞线粒体膜电位。结果（1）siRNA—iPLA2可明显抑制IMECs内iPLA2 mRNA的表达。（2）H2O2诱导后细胞DNA片段化程度随诱导时间的增加而增多，抑制iPLA2表达后细胞的梯状条带明显增亮。（3）干扰组和未干扰组、干扰阴性对照组相比凋亡率明显升高（P均〈0．01）。（4）与未干扰组比较，干扰组细胞线粒体膜电位明显下降（P〈O．01）。结论抑制iPLA2表达可促进H2O2诱导的IMECs凋亡。     

靶向乙型肝炎病毒X区的siRNAs对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对HepG2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低HepG2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。     

肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究

目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率.方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA 干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com（含有CTGF和TIMP-1）,进行酶切和测序鉴定.将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率.结果酶切与测序结果提示重组质粒 psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF ＋TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组（Com组,20±2%,P〈0.05）;在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF＋TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%（P〈0.05）.结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高.     

9型重组腺相关病毒转染大鼠心脏成纤维细胞的体外研究

目的:研究9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心脏成纤维细胞的转染效率及其对细胞生长的影响。方法:分离、获取并培养大鼠心脏成纤维细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-EGFP)转染大鼠心脏成纤维细胞,以转染复数(MOI)将细胞分为未转染病毒A组、B组MOI=1×104、C组MOI=1×105、D组MOI=1×106,倒置荧光显微镜下观察大鼠心脏成纤维细胞中EGFP的表达情况,观察转染后细胞生长形态,应用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对大鼠心脏成纤维细胞的转染效率,应用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响。结果:D组的细胞于转染后24h即可观察到EGFP表达,B组与C组细胞则于48h观察到EGFP的表达。倒置荧光显微镜下观察转染后大鼠心脏成纤维细胞生长及形态正常,镜下观察显示各组细胞表达EGFP的强度随MOI值的增高而增强,同时亦随着时间延长而增强,EGFP表达在转染120h达到高峰,此时检测rAAV9-EGFP对心脏成纤维细胞的转染效率,分别为B组:(2.6±0.2)%,C组:(7.3±1.4)%,D组:(45.1±2.7)%。AlamarBlue法检测表明转染组细胞各时点与未转染组的还原率比值接近于1。结论:rAAV9-EGFP能够有效转染大鼠心脏成纤维细胞,转染后EGFP基因能够有效得以表达,rAAV9对细胞增殖无明显抑制。9型重组腺相关病毒可作为基因治疗心脏疾病研究的理想载体。     

siRNA干扰嘌呤补救合成途径的关键酶对弓形虫增殖的抑制作用

目的探讨siRNA同时干扰嘌呤补救合成途径中两个关键酶对弓形虫增殖速率的影响。方法将针对腺苷激酶(AK)和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的siRNA同时电转染弓形虫,然后将弓形虫接种人包皮成纤维细胞(HFF),24h和40h后Giemsa染色,光镜下计数假包囊内弓形虫速殖子数目,计算弓形虫平均倍增次数。同时将弓形虫进行模拟电转,接种HFF细胞后,不加磺胺嘧啶进行培养作为阴性对照,加入10μg/mL磺胺嘧啶培养作为阳性对照。结果在接种HFF细胞后24h,4μmol/L的AK siRNA786和HXGPRT siRNA415联合电转弓形虫、阳性对照组及阴性对照组弓形虫的平均倍增次数分别为:1.64±0.95、1.04±0.88及2.32±0.90,前两组与后者相比倍增次数明显减少(P<0.05)。在接种后40h,siRNA联合电转弓形虫与阳性对照组弓形虫的平均倍增次数分别为3.00±1.04,2.56±1.04,与阴性对照组相比(3.60±0.80)差异有显著性(P<0.05)。结论嘌呤补救合成途径中的两个关键酶-AK和HXGPRT被其siRNA同时抑制后,弓形虫在细胞内的增殖速率显著减缓。