人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定

目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.     

基因工程技术制备的人源性抗Mr 48×103角蛋白抗体Fab片段的纯化与活性鉴定

目的用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体Fab片段,并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定. 方法将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,产物经金属鏊合层析纯化,并用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性、SDS-PAGE鉴定纯度和蛋白印迹检测抗角蛋白抗体Fab片段识别的抗原组分. 结果可溶性表达的抗角蛋白抗体Fab片段经金属鏊合层析可有效地纯化,蛋白印迹明确纯化产物为人Fab片段.所纯化的Fab片段在非还原SDS-PAGE中形成Mr 50×103单一条带,在还原SDS-PAGE中可见Mr 23×103,Mr 25×103两条带. ELISA和Western blot证实该片段具备良好的抗原结合活性和抗原特异性. 结论成功表达并鉴定了人源性抗Mr 48×103角蛋白的Fab可溶性片段,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了良好的基础.     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1特异性基因工程抗体Fab的筛选与特性

目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性?高亲和力的全人抗体Fab片段?方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性?结果:Western blot?免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA?荧光激活细胞分类术?免疫荧光分析?免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性?结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子?     

人源抗-HBs Fab表达系统的转换与效果

目的:重新克隆抗-HBs Fab基因于pBAD载体,改变诱导方式与表达条件,提升原核表达人源抗体片段的经济性与实用性.方法:经3次基因扩增,分步克隆,将Fd、Lc与pBAD/Lc基因先后插入到pBAD载体中,形成单载体双启动、定向表达形式.筛选双重插入菌落,阿拉伯糖诱导表达,PAGE和Western印迹鉴定抗-HBs Fab的表达效果.结果:酶切克隆载体,琼脂糖电泳证实Fd和pBAD/Lc基因的正确插入;PAGE可见明显的相对分子质量近50 000的蛋白区带,Western印迹显示该区带确为Fab;HBsAg特异印迹表明表达产物具有抗原结合活性.结论:比较原pComb3表达系统,改变后的pBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量(可达70 mg/L)并保持了抗体活性,为该抗体的批量制备与临床应用提供了条件.     

VEGF和Endostatin在分化型甲状腺癌中的表达及其意义

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)和内皮抑素(Endostatin)在分化型甲状腺癌组织中的表达情况及相关性.方法 应用免疫组织化学方法检测分化型甲状腺癌组织VEGF和Endostatin表达的情况,分析二者在分化型甲状腺癌组织表达的相关性.结果 分化型甲状腺癌组织中VEGF和Endostatin的表达比结节性甲状...     

人源抗Trop-2抗体Fab的制备及条件优化

目的:探讨人源抗Trop-2抗体片段Fab在大肠杆菌中的诱导表达,优化蛋白表达及纯化的条件?方法:将含有抗Trop-2 Fab 抗体基因的质粒转化宿主菌E.coli TOP10F ′大肠杆菌,比较诱导前培养液更换对抗Trop-2 Fab片段表达量的影响;比较不同诱导温度?诱导时间及诱导前加入葡萄糖对蛋白表达的影响;大量表达的抗Trop-2 Fab经亲和层析纯化后,用免疫荧光和流式细胞术检测其免疫学特性?结果:在培养液中加入5 g/L的葡萄糖,人源抗Trop-2抗体Fab片段的表达产量明显增加;16℃的诱导温度比其它温度能表达更多的Fab分子;加诱导剂12 h,目的蛋白的表达量至峰值?结论:本实验结果为在原核系统中大量制备抗Trop-2抗体片段及后续的肿瘤靶向治疗提供了基础?     

乐伐替尼治疗放射性碘难治性甲状腺癌的研究进展

背景:乐伐替尼是一种多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂,欧洲药品管理局(EMA)以及美国食品药品监督管理局(FDA)已于2015年批准乐伐替尼用于治疗甲状腺癌,尤其是局部复发或转移性、进行性、放射性碘难治性分化型甲状腺癌的患者~([1])。且2017年12月,乐伐替尼作为抗肝癌制剂被中国国家食品药品监督管理总局授予优先审批评审资格。本文主要就目前乐伐替尼在甲状腺癌中的临床研究进展进行讨论。笔者从Pubmed,Cochrane Library,EMBASE、中国国家知识基础设施数据库以及万方数据库进行了检索,然后对检索结果进行分析,以此对乐伐替尼治疗放射性碘难治性分化型甲状腺癌的无进展生存期(PFS)、客观应答率(ORR)和不良事件进行研究。目前的临床研究显示,乐伐替尼延长了放射性碘难治性分化型甲状腺癌患者的PFS,提升了ORR。高血压、腹泻、乏力或疲劳、食欲不振、体重下降等是其最常见的副作用。得出乐伐替尼可显著改善放射性碘难治性分化型甲状腺癌患者的PFS及ORR。尽管具有一些副作用,但它目前仍然是治疗甲状腺癌,尤其是放射性碘难治性分化型甲状腺癌最有希望的药物之一。     

抗人大肠癌抗体CAb-1 Fab基因的克隆、表达和鉴定

目的:从杂交瘤细胞中克隆mAb CAb-1所编码Fab抗体基因,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定.方法:采用RT-PCR方法,扩增mAb CAb-1的Fd片段和全长κ链基因,分别克隆到T载体后进行序列测定和分析.依次亚克隆两个基因到噬粒pComb3中,去除该载体上的gIII基因,构建成分泌表达载体Fd-L/pComb3.转化XL1-Blue E.coli菌株,IPTG诱导表达.采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性.结果:克隆了大肠癌mAb CAb-1的Fab基因,并在E.coli中获得表达.产物CAb-1 Fab具有与大肠癌细胞株SW480特异结合的活性.结论:成功构建了在E.coli中表达抗人大肠癌mAb CAb-1的小分子单价Fab抗体的载体.     

人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定

目的:将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体IgG,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性?方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建全分子IgG抗体重?轻链表达载体,共转染293 FreeStyle(293F)细胞,表达并纯化IgG抗体?应用ELISA及Western blot实验检测抗体免疫学活性,微量中和实验及鸡胚预防保护实验检测其中和活性,血凝抑制试验判断其结合血凝素亚基?结果:成功筛选出1株全人源抗H7N9血凝素Fab抗体基因并构建IgG真核表达载体?获得的全分子IgG抗体重?轻链序列正确,并可特异性结合H7N9血凝素?微量中和实验证明其对H7N9型禽流感病毒有良好中和活性,中和滴度为15.6 μg/mL?鸡胚预防保护实验显示抗体用量为200 μg时可达100%保护率?血凝抑制试验表明其结合血凝素HA2亚基?结论:制备的重组全人源全分子抗H7N9血凝素IgG抗体可特异性识别H7N9型禽流感病毒血凝素,对H7N9型禽流病毒有显著的中和作用,为进一步研发用于禽流感防治的抗体药物奠定基础?