大鼠海马神经元体外氧糖剥夺/复氧模型的构建

目的 建市体外培养的大鼠海马神经元氧糖剥夺(OGD)/复氧实验模型,并尝试确定该模型最合适的缺氧缺糖时间点.方法 新生SD乳鼠海马神经元原代培养7 d后,随机(随机数字法)分为OGD组和对照组.OCD组根据氧糖剥夺时间的不同又分为1 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h亚组.OGD组细胞置于含0.5%氧气的三气培养箱,同时将培养液换成无糖Earle氏液,模拟体内脑缺血损伤.复氧复糖24 h后观察对照组和OCD各组的神经元形态,测定MTT细胞光密度值(OD)和培养液LDH含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率.所得数据采用SPSS 16.0统计软件行单因素方差分析(Dunnett-t检验)和Spearman等级相关分析.结果 随着缺氧缺糖时间的延长,OGD各组神经元形态学损伤逐步加重,细胞OD值和存活率逐渐下降(rs=-0.961和rs=-0.966,P<0.01),LDH值逐渐升高(rs=0.990,P<0.01),细胞凋亡率明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05).OGD6 h时,细胞的凋亡率接近50%.结论 成功建立了大鼠海马神经元体外氧糖剥夺/复氧模型,结合形态学改变和细胞凋亡率,建议将6 h作为该模型合适的缺氧缺糖损伤时间.     

糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

背景:缺氧作为神经系统疾病发展过程中诸多病理因素中最常见的因素之一,对于内源性神经干细胞以及移植后外源性神经干细胞的存活、迁移、分化、凋亡发挥着诸多调控作用。目的:系统观察糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响。方法:从新生鼠嗅球分离培养出神经干细胞,建立糖氧剥夺模型,免疫荧光技术检测糖氧剥夺后神经干细胞分化能力,MTT法检测糖氧剥夺24,48 h后恢复正常条件培养对神经干细胞增殖能力的影响,Hochest33258荧光染色检测糖氧剥夺24,48 h后神经干细胞凋亡状况。结果与结论:第4代神经干细胞CD133免疫荧光鉴定结果呈阳性表达,MTT细胞增殖能力检测结果示:糖氧剥夺组增殖能力明显低于常氧组(P<0.05),糖氧剥夺48 h组增殖能力低于糖氧剥夺24 h组(P<0.05)。GFAP、β-TubulinⅢ细胞免疫荧光染色结果示糖氧剥夺48 h后神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元总数明显低于常氧组(P<0.05)。Hochest33258染色凋亡率检测结果示糖氧剥夺组细胞凋亡率明显高于常氧组(P<0.01),糖氧剥夺48 h组神经干细胞凋亡率显著高于糖氧剥夺24 h组(P<0.01)。上述结果表明糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡造成不利影响,影响程度取决于缺氧浓度、缺氧时间及自身对于缺氧的耐受性。     

氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺-再灌注损伤中的抗凋亡作用

目的 观察氧糖剥夺后处理在缺氧缺糖再灌注损伤中的抗凋亡作用.方法 应用SK-N-SH细胞进行氧糖剥夺4h,然后恢复氧糖20 h建立氧糖剥夺-再灌注损伤模型,3次循环的氧糖剥夺10 min/复氧糖10 min进行氧糖剥夺后处理;细胞分为对照组、氧糖剥夺-再灌注组(OGD/R组)与后处理组,MTT法与Hoechst33258染色分别检测氧糖剥夺后处理对细胞存活率与凋亡的影响.结果 OGD/R组细胞存活率较对照组下降约43％ (P＜0.01),后处理组细胞存活率比OGD/R组提高约22％(P＜0.01);凋亡计数显示,OGD/R组和后处理组的细胞凋亡率较对照组增高(P＜0.01),而后处理细胞凋亡率低于OGD/R组(P＜0.01).结论 氧糖剥夺后处理能提高氧糖剥夺-再灌注损伤细胞的存活率,可能与其抑制细胞凋亡有关.     

HET0016对延迟性亚低温保护氧糖剥夺-复氧复糖离体神经元的强化效应

目的探讨HET0016对延迟性亚低温保护氧糖剥夺-复氧复糖(oxygen-glucose deprivation and restoration,OGD/R)离体神经元的强化效应。方法新生24~48h的SD大鼠12只,随机分为对照组、氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)组、OGD/R-亚低温(OGD/R-mild hypothermia,OGD/R-HM)组、OGD/R-HM-HET0016(OGD/R-HM-HET)组各3只,均分离海马神经元细胞培养7d,制备海马神经元OGD/R模型。对照组应用3mL含葡萄糖earle's平衡盐溶液正常条件下培养2h后更换正常培养液继续培养28h;OGD组应用3 mL无葡萄糖平衡盐,37℃、体积分数1%氧气培养箱中培养2h后更换正常培养液继续培养28h;OGD/R-HM组应用3mL无葡萄糖培养液、体积分数1%氧气培养箱培养2h后更换正常培养液,37℃、体积分数5%CO2培养箱中复氧4h后亚低温处理24h;OGD/R-HM-HET组于复氧前加入HET0016,调整终浓度1μmol/L,余处理同OGD/R-HM组。应用流式细胞仪检测4组细胞凋亡率。结果流式细胞仪检测结果显示,神经元细胞凋亡率在OGD组[(29.59±0.60)%]、OGD/R-HM组[(19.89±0.39)%]、OGD/R-HM-HET组[(14.17±0.25)%]均高于对照组[(1.63±0.42)%](P0.05),且OGD组高于OGD/R-HM组和OGD/R-HM-HET组(P0.05),OGD/R-HM组高于OGD/R-HM-HET组(P0.05)。结论 HET0016对缺血缺氧4h后实施的亚低温保护离体OGD/R神经元具有一定的强化效应。     

PC12细胞缺血预处理模型的建立及一氧化氮的保护作用

目的 以PC12细胞建立体外脑缺血预处理细胞模型,探讨NO在预处理脑保护中的作用.方法 建立缺血预适应的细胞模型,随机分为四组,每组五碟细胞.正常对照组:常氧、低糖(<1g/L)2%胎牛血清DMEM培养;缺血预适应组(IPC):预先氧糖剥夺(OGD)6 h,后经复灌和OGD处理;非缺血预适应组(NIPC):常氧、低糖低血清培养6 h,后经复灌和OCD处理;一氧化氮合酶抑制剂组(L-NAME):OGD预处理前30 min加L-NAME,OGD6 h,后经复灌和OGD处理.通过细胞MTT代谢率、乳酸脱氢酶(LDH)释放量、细胞凋亡率来评判IPC模型是否建立,生化法观察各组一氧化氮合酶(NOS)活性变化.统计分析利用单因素方差分析,两两组间均数的比较用LSD法,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 与NIPC组比较,IPC组MTT代谢率明显增高(94.9%±15.1%,P<0.05),LDH释放量减少(279.1%±28.1%,P<0.01),细胞凋亡率降低;与对照组(100.0%±13.5%)比较,NIPC组及IPC组NOS活性均升高(190.0%±14.6%,P<0.01;126.10k±10.6%,P<0.01);流式检测结果显示,对照组、IPC组、NIPC组和L-NANE组引起的细胞凋亡率分别为5.90%,8.71%,18.62%及11.73%.结论 IPC减少PC12细胞缺糖缺氧损伤后细胞的死亡与凋亡,且NO参与了此保护机制,但并非唯一因素.     

他莫昔芬对小胶质细胞氧糖剥夺后迁移和增殖的影响

目的:观察他莫昔芬(TAM)对氧糖剥夺(OGD)模型中小胶质细胞BV-2增殖和迁移的影响。方法:将BV-2细胞分为对照组(常规正常氧浓度+高葡萄糖+无胎牛血清培养基)、OGD组(1%氧浓度+无糖+无血清培养基)、OGD+TAM组(1%氧浓度+无糖+无血清培养基+TAM),采用划痕试验,通过免疫荧光技术检测小胶质细胞BV-2在不同氧浓度下的增殖和迁移情况。同时观察TAM对小胶质细胞活化的调节作用。结果:与对照组相比,BV-2在OGD后细胞迁移加快(P<0.05);OGD+TAM组迁移较OGD组下降(P<0.05);OGD组Ki67阳性率的BV-2明显高于对照组(P<0.05);OGD+TAM组Ki67阳性率则明显低于OGD组(P<0.05)。结论:缺氧可诱导小胶质细胞活化,雌激素受体拮抗剂TAM能有效抑制这种活化。     

层粘连蛋白与脑微血管内皮细胞对正常及缺氧条件下培养的神经干细胞分化的影响

[目的]探讨层粘连蛋白(LN)与脑微血管内皮细胞(CMECs)对正常及缺氧条件下培养的神经干细胞(NSCs)分化的影响.[方法]原代分离培养CMECs和NSCs,实验分为常氧组(NSCs+NSCs完全培养基)、缺氧组(缺氧NSCs+NSCs完全培养基)、常氧合培养组(NSCs+NSCs完全培养基+LN+CMECs)、缺氧合培养组(缺氧NSCs+NSCs完全培养基+LN+CMECs),分别于6 h、1 d、3 d、7 d等时间点用免疫细胞化学方法比较NSCs的分化情况.[结果]①NSCs缺氧培养6 h后较正常NSCs神经元、星型胶质细胞分化率差异无显著性(P>0.05);②6 h开始,常氧合培养组较常氧组NSCs神经元分化比率增加,星型胶质细胞分化比率下降,差异具有显著性(P<0.05);③1 d开始,缺氧合培养组较缺氧组NSCs神经元分化比率增加,3 d开始,星型胶质细胞分化比率下降,差异具有显著性(P<0.05);④3 d开始,缺氧合培养组较常氧合培养组NSCs星型胶质细胞分化比率下降,7 d开始,缺氧合培养组较常氧合培养组NSCs神经元分化比率增加,差异具有显著性(P<0.05).[结论]①短时间缺氧培养对NSCs细胞分化类型无明显改变;②LN及RCMECs可使正常及缺氧损伤的NSCs神经元分化比率提高.     

银杏叶提取物对神经元缺糖缺氧/复糖复氧性损伤的作用

目的研究银杏叶提取物(EGB761)对体外培养神经元缺糖缺氧/复糖复氧性损伤的作用,并探讨其作用机制。方法利用体外培养的皮层神经元,通过去除培养液中的葡萄糖和氧气(oxygen andglucose deprivation,OGD)模拟缺血缺氧,恢复糖氧供给模拟再灌流。再灌流时分三组加入不同浓度的EGB761观察其作用。噻唑盐比色法(MTT)测定细胞活性,碘化丙锭(PI)与Hoechst33258双染色观察神经元凋亡,免疫蛋白印迹法测定Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果EGB761可减少缺糖缺氧/复糖复氧导致的神经元凋亡,提高因该损伤而下降的MTT值以及Bcl-2蛋白的表达。Bax蛋白在EGB761处理前后均无明显变化。结论EGB761可拮抗缺糖缺氧/复糖复氧导致的神经元凋亡,并且该作用可能与诱导Bcl-2蛋白表达有关。     

骨髓间充质干细胞及补脑Ⅰ号处理后血清对小鼠海马神经元缺氧缺糖模型ICAM-1、NF200表达的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（BMSCs）、补脑Ⅰ号血清对小鼠海马神经元缺氧缺糖（OGD）模型神经中丝200（NF200）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）的影响。 方法分离培养BMSCs、海马神经元,对海马神经元进行OGD造模。制备补脑Ⅰ号血清与正常血清。经MTT法筛选补脑Ⅰ号血清对海马神经元OGD模型干预的最佳浓度为10%,时间为72 h。实验分为正常组、模型组、BMSCs组、正常血清组、中药血清组、BMSCs＋正常血清组、BMSCs＋中药血清组。qRT-PCR检测细胞NF200、ICAM-1 mRNA表达;Western Blot检测细胞NF200、ICAM-1蛋白表达。 结果与正常组比较,模型组、BMSCs组、正常血清组、BMSCs＋正常血清组、中药血清组、BMSCs＋中药血清组ICAM-1、NF200 mRNA及蛋白表达升高（P＜0.05）;与模型组比较,BMSCs组、BMSCs＋正常血清组、中药血清组、BMSCs＋中药血清组NF200 mRNA及蛋白表达升高,ICAM-1 mRNA及蛋白表达降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;BMSCs＋中药血清组较BMSCs组、正常血清组、中药血清组及BMSCs＋正常血清组的NF200 mRNA及蛋白表达升高,ICAM-1 mRNA及蛋白表达减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论BMSCs和补脑Ⅰ号血清可能通过抑制炎症、促进神经再生及双重作用修复OGD损伤的海马神经元,两者联合应用效果优于单独使用。     

右美托咪啶对大鼠缺氧缺糖海马神经元凋亡的影响

目的:探讨右旋美托咪啶(DEX)在大鼠海马神经元细胞中对缺氧缺糖(OGD)损伤导致的细胞凋亡的影响。方法:取培养8 d的原代新生大鼠海马神经元细胞随机分为4组:正常对照组、OGD模型组、DEX对照组和DEX处理组。建立大鼠原代海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖损伤模型,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位(MMP)变化,DCFH-DA染色检测细胞内活性氧(ROS)水平变化。结果:与对照组相比,OGD损伤可明显降低细胞内MMP水平,而右旋美托咪啶预处理可抑制MMP的降低,并可抑制OGD介导的ROS生成。结论:右美托咪啶对大鼠海马神经元OGD损伤具有保护作用,其机制与抑制ROS生成和抑制MMP下降相关。     

辛伐他汀抑制高糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡

背景：他汀类药物对血管内皮细胞的凋亡是否有影响目前尚不明确。目的：探讨辛伐他汀对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法：用DMEM细胞培养液培养人脐静脉内皮细胞,将细胞分成空白对照组、高糖组和高糖＋辛伐他汀组,用四甲基偶氮唑蓝比色法测定人脐静脉内皮细胞的存活率,流式细胞仪和Westernblot分别检测细胞早期凋亡率及P53蛋白表达。结果与结论：高糖组及高糖＋辛伐他汀组细胞增殖率较空白对照组明显降低（P〈0.01）,而高糖组细胞增殖率较高糖＋辛伐他汀组亦降低（P〈0.01）;高糖组P53蛋白表达量及凋亡率较空白对照组及高糖＋辛伐他汀组明显增加（P〈0.01）,高糖＋辛伐他汀组P53蛋白表达及凋亡率亦明显高于空白对照组（P〈0.01）。表明高糖可通过促进促凋亡蛋白P53的表达进而促进人脐静脉内皮细胞的凋亡,而辛伐他汀可抑制此作用。     

心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的作用

背景：心肌营养素1属于白细胞介素6细胞因子家族,近年发现其可能对中枢神经系统有重要保护作用。目的：探索重组腺病毒心肌营养素1对谷氨酸诱导神经干细胞凋亡的保护作用,为脑损伤提供新的治疗措施。方法：取新生Wistar大鼠海马神经干细胞,第2代培养第5天用于实验,神经干细胞分为3组：谷氨酸组、重组腺病毒心肌营养素1组及对照组,利用四唑蓝比色了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术检测细胞凋亡。结果与结论：谷氨酸组神经干细胞呈现明显形态改变,重组腺病毒心肌营养素1组未见类似改变,在谷氨酸暴露后12,24,48及72hMTT吸光度值均低于心肌营养素1组,而细胞凋亡率均高于心肌营养素1组。与其他两组比较,对照组相同时间点A值增高,细胞凋亡率降低。提示,心肌营养素1对谷氨酸损伤的神经干细胞具有保护作用,可以抑制神经干细胞凋亡,促进其存活和增殖。     

高压氧对大鼠脊髓损伤后移植神经干细胞增殖分化的影响

目的：探讨高压氧（HBO）对大鼠脊髓全横断损伤后移植的神经干细胞存活、增殖及分化的影响。方法：成年健康SD大鼠20只,随机分为神经干细胞移植组（NSCs组）和HBO联合神经干细胞移植组（HBO＋NSCs组）各10只。2组均采用脊髓全横断损伤模型,术后均给予NSCs移植治疗,HBO＋NSCs组在移植后辅以HBO治疗。治疗后检测移植在脊髓损伤处的神经干细胞存活、增殖及分化的情况。结果：术后第28d,HBO＋NSCs组移植的神经干细胞存活数量显著多于NSCs组（P〈0．05）。2组大鼠的脊髓损伤处及其相邻的组织均可观察到较多移植的神经干细胞分化为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性染色细胞。HBO＋NSCs组中移植的神经干细胞分化为神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性染色细胞百分率显著高于NSCs组（P〈0．05）。结论：HBO能够促进大鼠脊髓损伤处移植的神经干细胞存活、增殖,并能促进这些细胞能分化为NSE阳性神经元。     

依达拉奉在星形胶质细胞持续缺糖缺氧损伤中的作用

【目的】研究自由基清除剂依达拉奉对持续缺糖缺氧诱导的星形胶质细胞（AS）损伤的影响。【方法】用缺糖缺氧4h处理大鼠原代AS星形胶质细胞作为As持续缺血的体外模型,实验分为4组：①空白对照组,②依达拉奉对照组（300uM）,③缺糖缺氧组,④依达拉奉（300uM）＋缺糖缺氧组。测定各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放量,观察并测定细胞内活性氧簇（ROS）含量、线粒体膜电位（MMP）水平。【结果】AS经持续缺糖缺氧损伤后,与空白对照组相比,细胞LHD释放量及ROS含量显著增加（P〈0．05）,MMP显著下降（P〈0．05）;依达拉奉＋缺糖缺氧组与缺糖缺氧组相比,细胞LDH释放量及R0s含量显著下降（P〈0．05）,MMP显著升高（P〈0．05）;依迭拉奉对照组与空白对照组相比3项指标无显著差异（P〉0．05）。【结论】依达拉奉通过减轻氧化应激、保护线粒体功能,减轻持续缺糖缺氧诱导的As。     

浅低温联合七氟烷对大鼠海马脑片氧糖缺失损伤细胞外氨基酸含量的影响

目的:在离体海马脑片缺氧无糖(OGD)损伤模型上用反向高效液相色谱(HPLC)技术探讨氨基酸递质在浅低温联合七氟烷脑保护中的作用。方法:制备并孵育好雄性SD大鼠的海马脑片OGD损伤模型,随机分为4组(每组n=8):氧糖缺失组(OGD组)、七氟烷组(Sev组)、浅低温组(MH组)、浅低温加七氟烷组(MH+Sev组)。各组在不同处理后检测OGD损伤开始之前、结束即时、复氧30 min和60 min时细胞外液天门冬氨酸(aspartic acid,Asp)、谷氨酸(glutamic acid,Glu)、牛磺酸(taurine,Tau)、甘氨酸(glycine,Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的浓度。结果:与OGD组相比,其余3组在OGD结束后各个时间点Glu、Asp和Gly浓度降低,Tau和γ-GABA浓度增加,MH+Sev组较其余3组在OGD结束后各个时间点中Asp和Glu的浓度显著降低(P<0.01,P<0.05),Tau和γ-GABA浓度显著增加(P<0.01),Gly浓度也有所降低。结论:浅低温(32℃)联合4%七氟烷后抗海马脑片OGD损伤作用得到加强,其作用机制可能与减轻细胞外液兴奋性氨基酸的聚积及机体建立抑制性保护机制有关。     

脑室周围白质软化症的体外模型中磷酸化ERK蛋白的表达及应用PD98059后对其表达的影响

目的观察体外构建脑室周围白纸软化症（Periventricular leukomalacia,PVL）模型的发病过程中磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylated extracellular signal regulated kinase,p-ERK）的表达变化及应用ERK通路抑制剂PD98059后对其表达的影响,以探讨ERK通路是否参与PVL的发病过程。方法共分为三种干预方法：给予CG4细胞糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）6,12,24hr,以构建PVL体外模型,检测p-ERK蛋白表达变化;给予CG4细胞OGD6,12,24hr后诱导分化3davs,以构建PVL后分化发育的体外模型,检测p-ERK蛋白表达变化;PD98059干预后给予OGD12,24hr,检测p-ERK表达的变化。以上蛋白检测均采用蛋白免疫印迹方法。结果与对应时间点的正常对照组比较,OGD实验组p-ERK在OGD6,12,24hr后均出现明显的下降（P〈0．01）;OGD后诱导分化3days实验组,p-ERK在OGD6hr后诱导分化先出现暂时性的表达升高,随后在12和24hr时间点,p-ERK表达均出现明显的下降（P〈0．01）;应用PD98059后OGD12,24hr实验组,p-ERK反而出现明显的升高（P〈0．01）。结论在构建的PVL和随后的分化发育的体外疾病模型中,ERK信号转导通路参与其中。此外,PD98059作为ERK通路的抑制剂在OGD过程中反而起到激活的作用。     

人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及丙二醛、抗氧化因子合成与波动性高糖的影响

背景：研究表明波动性高血糖较持续性高血糖对血管内皮功能的损害可能更严重。目的：观察波动性高糖对人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及丙二醛、抗氧化因子合成的影响。方法：密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞。取经培养鉴定后的内皮祖细胞,细胞同化后分别给予5.5mmol/L,20mmol/L,5.5/20mmol/L葡萄糖（5.5,20mmol/L的葡萄糖培养液每8h更换1次）及20mmol/L甘露醇。干预72h后,MTT法检测内皮祖细胞的增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;比色法测定培养液中丙二醛水平及超氧化物歧化酶活力。结果与结论：20mmol/L和5.5/20mmol/L葡萄糖作用72h,内皮祖细胞增殖减少、凋亡率增高（P〈0.01）,培养液中丙二醛水平增高、超氧化物歧化酶活力降低（P〈0.01）,均以5.5/20mmol/L葡萄糖作用最明显（P〈0.01）。说明波动性高糖较恒定性高糖更易抑制内皮祖细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与波动性高糖环境下氧化应激水平增高有关。