栀子苷拮抗内毒素的实验研究

目的 研究栀子苷的抗内毒素/脂多糖生物学活性。方法 应用生物传感器技术检测栀子苷与LPS活性中心Lipid A的结合活性、动态比浊法鲎试验检测栀子苷(0、2.5、5.0、10.0 mg/L)对LPS(0.1 μg/L)的中和活性、ELISA法检测栀子苷(0、25、50、100 mg/L)对LPS(100 μg/L)刺激RAW264.7细胞释放细胞因子的影响,进而观察栀子苷(0、10、20、40 mg/kg)对致死剂量LPS攻击模型小鼠的保护作用。结果 栀子苷与Lipid A具有结合活性,量效关系明显;栀子苷(2.5、5.0、10.0 mg/L)在体外对LPS(0.1 μg/L)具有显著的直接中和作用(P<0.01);栀子苷在50-100 mg/L浓度水平能够显著抑制LPS(100 μg/L)刺激RAW264.7细胞释放TNF-α(P<0.01);40 mg/kg的栀子苷对脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用(P<0.01)。结论 栀子苷可能通过与Lipid A结合中和LPS的活性,抑制LPS介导的细胞活化,减少细胞因子释放,进而保护脓毒症模型小鼠。     

京尼平苷对LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应的抑制作用

目的明确京尼平苷对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应的抑制作用。方法以LPS诱导原代培养的星形胶质细胞为细胞模型,随机分为对照组、LPS组、LPS+白藜芦醇组和LPS+不同浓度京尼平苷组,采用Western Blot法检测星形胶质细胞活化标记物GFAP水平及NF-κB p65水平,ELISA法检测致炎细胞因子水平。结果京尼平苷可显著抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化,降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,同时NF-κB p65蛋白的表达也明显降低。结论京尼平苷能通过NF-κB途径抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化,并抑制致炎细胞因子水平。     

大黄拮抗CpG DNA有效成分的分离制备及活性研究

目的：脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征,至今无有效的治疗手段。细菌Cp6DNA是引起脓毒症的主要病原分子。CpGDNA通过与TLR9结合,介导单核／巨噬细胞的活化,是介导脓毒症发生的重要途径。本研究以CpGDNA为靶点,从中药中定向分离具有拮抗CpGDNA和治疗脓毒症作用的活性物质。方法：（1）应用生物传感器技术、建立以CpGDNA为靶点的筛选抗炎中药的技术平台并对78种中药进行筛选;（2）利用生物传感器技术、硅胶柱层析、离子交换柱层析技术,从大黄中定向分离与CDGDNA具有较高结合活性的组分,并对得到的组分进行初步的活性评价,确定活性组分;（3）在体外实验中,测定活性组分与CpGDNA、lipidA的结合能力,观察活性组分对LPS、CpGDNA刺激小鼠RAW264．7细胞分泌炎症介质的抑制作用,在体内实验中,观察活性组分对致死剂量热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护作用。（4）利用反相HPLC技术对活性组分进行制备分离,获得活性单体化合物;（5）在体外实验中,检测单体化合物与CpGDNA和lipidA的结合能力．观察化合物对LPS、CpGDNA刺激小鼠RAW264．7细胞分泌炎症介质的抑制作用。结果：（1）建立了以CpGDNA为靶点应用生物传感器筛选抗炎中药的技术平台;从78种中药中筛选出大黄等14种中药与CpGDNA具有较高结合能力;（2）利用生物传感器技术、硅胶柱层析、离子交换柱层析等技术从大黄水提物中定向分离得到与CpGDNA有较高结合活性大黄D组分;（3）在体外,大黄D组分与CpGDNA、LipidA均具有较高的结合活性,对CpGDNA及LPS刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF-α有显著的抑制活性,并呈现良好的量一效关系。在体内,大黄D组分对致死剂量的热灭活大肠杆菌攻击小鼠有显著的保护作用,并呈现良好的量-效关系;（4）通过反相HPLC从D组分中分离得到单体化合物大黄酸和大黄素;（5）在体外,大黄酸和大黄素与CpGDNA均具有较高结合能力,均能单独或协同对CpGDNA及LPS刺激RAW264．7细胞分泌TNF—Q产生显著抑制作用。结论：（1）应用生物传感器、以病原分子CpG DNA为靶点,成功地建立了筛选抗炎中药的技术平台;（2）从大黄中分离得到与CpGDNA有较高结合活性的大黄D组分,体内、外生物学活性评价结果显示：大黄D组分对CpGDNA及LPS刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF—α具有显著的抑制活性,并对致死剂量的热灭活大肠杆菌攻击小鼠有显著的保护作用;（3）从大黄D组分中分离得到单体化合物大黄酸和大黄素,生物学活性评价结果显示,大黄酸和大黄素对CpGDNA及LPS刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF—α具有显著的抑制活性,提示大黄酸和大黄素可能是D组分以及大黄提取物拮抗cpGDNA和脓毒症的主要物质基础。     

京尼平苷对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的影响

目的探讨京尼平苷对链脲佐菌素诱导的1型糖尿病性神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及可能作用机制。方法通过链脲佐菌素诱导的SD大鼠建立糖尿病性神经病理性疼痛模型,将大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组(加巴喷丁)及不同剂量京尼平苷处理组(1,10和100mg·kg-1)。建模后第21天给予不同剂量京尼平苷,连续给药7d。免疫荧光组织化学法观察脊髓背角小胶质细胞活化情况,ELISA法观察脊髓致炎细胞因子水平。结果连续给予京尼平苷对糖尿病大鼠机械痛敏具有较好的镇痛作用,同时观察到京尼平苷可显著抑制脊髓背角小胶质细胞活化及致炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平;同时京尼平苷可降低糖尿病大鼠的血糖水平。结论京尼平苷对糖尿病性神经病理性疼痛具有较好的镇痛作用,其机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞活化及致炎细胞因子水平有关。     

青蒿琥酯通过降低TLR4和TLR9mRNA表达保护大肠杆菌脓毒症模型小鼠

目的：观察抗疟药青蒿琥酯对脓毒症模型小鼠的保护作用，探讨其保护作用可能的机制。方法：采用热灭活大肠杆菌建立脓毒症小鼠模型，观察青蒿琥酯对小鼠生存率的影响；采用ELISA法和鲎试剂动态浊度法在体研究青蒿琥酯对脓毒症小鼠血清TNF-α及内毒素水平的影响；采用小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264．7细胞从离体水平观察青蒿琥酯对不同致炎因子LPS、CpG ODN和热灭活大肠杆菌诱导细胞因子TNF-α和IL-6释放的影响；采用生物传感器技术、流式细胞技术及RT-PCR分别研究青蒿琥酯与LPS和cpG ODN的直接结合、对细胞表面结合及内吞及TLR4和TLR9mRNA表达的影响。结果：青蒿琥酯对热灭活大肠杆菌脓毒症小鼠具有明显保护作用，可明显降低血清TNF-α及内毒素水平；青蒿琥酯在体外不能直接中和或结合LPS和cpGODN，但可抑制抑制热灭活大肠杆菌、LPS和CpG ODNl826诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL-6的释放；青蒿琥酯对细胞内吞或表面结合没有影响，但可抑制热灭活大肠杆菌、LPS和CpG ODNl826诱导的RAW264．7细胞TLR4和TLR9 mRNA高表达。结论：青蒿琥酯可通过降低血清TNF-α释放及内毒素水平保护大肠杆菌脓毒症模型小鼠，其作用可能与降低TLR4和TLR9 mRNA表达有关。     

京尼平苷和京尼平研究及应用现状

环烯醚萜类化合物京尼平苷(栀子苷)及其苷元京尼平具有多种药理活性和广泛应用价值,一直是国内外学者研究的热点。系统综述了京尼平苷及京尼平在植物中分布、分离(制备)纯化、定量测定、药物代谢、药理活性和应用现状,并对其毒性进行简单概述,为京尼平苷及京尼平的进一步研究和开发提供参考,也为其临床应用提供科学依据。     

栀子抗炎活性成分的初步考察

摘要：目的:研究中药栀子（Gardenia jasminoides Ellis）中具有抗炎活性的化学成分。方法:栀子干燥果实70%乙醇提取物采用HP-20大孔树脂、硅胶、MCI、ODS柱色谱以及反相MPLC、HPLC等技术进行分离纯化,根据化合物的光谱数据和理化性质进行结构鉴定。采用LPS诱导小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞模型,以细胞中前列腺素E2（PGE2）分泌量为评价指标对分离到的化合物进行体外抗炎活性评价。结果:从中分离10个化合物,分别鉴定为绿原酸（1）、新绿原酸（2）、隐绿原酸（3）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（4）、东莨菪内酯（5）、邻苯二甲酸二丁酯（6）、京尼平苷（7）、6’’-O-反-桂皮酰基京尼平龙胆二糖苷（8）、6’’-O-反-芥子酰基京尼平龙胆二糖苷（9）、6’’-O-反-阿魏酰基京尼平龙胆二糖苷（10）。其中化合物4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（4）、东莨菪内酯（5）和6’’-O-反-桂皮酰基京尼平龙胆二糖苷（8）对LPS诱导的RAW 264.7细胞中PGE2的分泌具有良好的抑制作用。结论:化合物4、5和8可能为栀子发挥抗炎功效的药效物质基础之一。     

高密度脂蛋白（HDL）拮抗内毒素的实验研究

目的：通过对高密度脂蛋白（HDL）体内外生物学活性实验研究，探讨HDL对内毒素的中和作用。方法：应用勤和生物传感器技术检测HDL与LPS的结合活性，采用ELISA方法检测HDL对LPS攻击小鼠的保护作用等试验来阐明HDL对LPS的中和效果。结果：应用亲和生物传感器亲和力检测，结果发现HDL与lipidA之间具有很高的．木和能力；HDL可以显抑制LPS刺激小鼠RAW264．7细胞释放TNF—α，并成量效关系；在小鼠体内使用剂量为120mg／kg的HDL可以明显保护致死剂量LPS攻击小鼠，保护率达到70％。结论：HDL在体内外与LPS结合，从而抑制了LPS的生物学活性，被认为是一种内毒素清除剂，对防治脓毒症具有临床指导意义，     

赤芍拮抗内毒素活性的实验研究

目的:提取分离中药赤芍中拮抗内毒素(LPS)的有效成分并进行药理学活性检测。方法:通过生物传感器,结合常规的中药分离技术,分离提取出赤芍拮抗LPS的有效成分,应用鲎实验和ELISA法检测该有效成分对LPS的中和作用。结果:赤芍中的有效成分与LPS具有较高的结合作用,该结合作用具有较强的中和LPS活性,在体外能够显著抑制由LPS介导小鼠RAW 2 6 4.7细胞释放TNF α。结论:以LPS为靶点,应用生物传感器技术,可快速、有效地提取分离赤芍中具有较强的中和LPS活性的有效成分。     

栀子大黄汤配伍变化对栀子中京尼平苷药动学的影响

目的：通过测定栀子、栀子-大黄、栀子-大黄-枳实和栀子大黄汤4种汤剂中京尼平苷在大鼠体内的药动学参数,考察栀子大黄汤配伍的变化对栀子中京尼平苷药动学的影响。方法：将SD大鼠随机分为4组,分别灌胃给予栀子、栀子-大黄、栀子-大黄-枳实、栀子大黄汤汤剂7．7、6．9、7．3、8．2mL·kg^-1,采用HPLC法测定各汤剂给药后5、10、20、30、60、90、120、240、360和480分钟时的血药浓度,并用BAPP2．0软件计算药动学参数。结果：栀子、栀子-大黄、栀子-大黄-枳实和栀子大黄汤组中京尼平苷的Gmax分别为（2．47±0．47）、（2．15±0．49）、（3．95±0．18）、（3．31±0．86）mg·L^-1;t1／2分别为（163±24）、（176±14）、（282±16）、（227±41）min;AUC0-t分别为（369±38）、（348±61）、（814±74）、（549±58）mg·L^-1·min^-1。与栀子组相比,栀子-大黄组中京尼平苷的Cmax和AUC0-t略有下降,栀子-大黄-枳实组和栀子大黄汤组中京尼平苷的Cmax和AUC0-t均显著升高,但栀子大黄汤组中京尼平苷的AUC0-t显著低于栀子-大黄-枳实组（P〈0．05）。结论：栀子大黄汤药材不同配伍对京尼平苷的药动学存在不同的影响,大黄可使京尼平苷的生物利用度略微下降,枳实可显著增加京尼平苷的生物利用度,淡豆豉则可显著降低京尼平苷的生物利用度。     

青蒿素防治细菌脓毒症的实验研究

目的 革兰阴性菌细胞外膜成分脂多糖／内毒素（Ljpopolysaccharide／endotoxin）和存在于革兰阴性、阳性细菌的基因组DNA（CpGDNA）是导致细菌脓毒症发生的主要致炎因子：但细菌脓毒症仍缺乏有效的治疗措施。本课题旨在明确青蒿素防治细菌脓毒症的作用及机制，为青蒿素的老药新用提供实验依据？方法①体外培养小鼠RAW264，7细胞，观察青蒿素对CpGDNA、LPS和热灭活大肠杆菌诱导RAW264．7细胞释放TNF—α和IL-6的抑制作用；②建立小鼠脓毒症模型，观察青蒿素对CpGDNA、LPS和热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护作用；     

染料木素通过TIPE 2负性调控Akt活性促进脂多糖活化的巨噬细胞凋亡

目的探究染料木素(genistein,GEN)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)活化的RAW264.7细胞凋亡的影响及其可能的药理学作用机制。方法GEN预孵育RAW264.7细胞或慢病毒介导的肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2,TIPE 2)过表达细胞2 h,再与LPS共孵育24 h,采用CCK 8试剂盒检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡水平,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6、caspase-8、caspase-3和TIPE 2 mRNA,Western blot检测iNOS、COX-2、caspase-8、caspase-3、TIPE 2、Akt和p-Akt蛋白表达。结果LPS促进RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2合成;GEN抑制LPS活化的RAW264.7细胞活力,凋亡细胞增多,并上调caspase-8、caspase-3、TIPE 2 mRNA及蛋白表达;TIPE 2过表达上调活化RAW264.7细胞caspase-8、caspase-3 mRNA及蛋白表达,减少Akt磷酸化,且与GEN具有协同作用。结论GEN可能通过上调TIPE 2抑制Akt活性,激活外源性凋亡途径,促进LPS活化的RAW264.7细胞凋亡。     

CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用

目的明确抑制性CpGODN208（CpG-NODN）对刺激性CpGODN1826（CpG-SODN）诱导单核／巨噬细胞分泌TNF-α的影响，为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法选用本室前期筛选出的对CpG。SODN活化RAW264．7细胞有抑制作用的CpG-NODN，观察其对CpG-SODN诱导hPBMC释放TNF-α的影响；应用流式细胞术观察CpG-NODN对CpG-SODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果浓度比为1：1的CpG-NODN对刺激性CpG-SODN诱导hPBMC分泌TNF-α具有抑制作用，并呈一定时效关系；CpG-NODN对CpG-SODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论CpG-NODN对CpG-SODN活化hPBMC具有抑制作用，这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpG-SoDN有关。     

玉米须提取物抑制肿瘤坏死因子-α和 细菌脂多糖诱导的细胞粘附和ICAM-1表达

人内皮细胞经一些细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α或脂多糖(LPS)处理,可诱导几种粘附分子的表达,并能增强白细胞与内皮细胞表面的粘附。抑制白细胞的粘附或抑制粘附分子的上调是治疗细菌脓毒症和各种炎症性疾病的重要靶点。在寻找具有市场前景的含TNF拮抗活性的欧洲抗炎草本植物中,玉米须的乙醇粗提物显示显著的抑制内     

蛇六谷葡苷露聚糖对小鼠巨噬RAW264.7细胞免疫调节作用及机制研究

目的探讨蛇六谷葡苷露聚糖(KGM)对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用及机制。方法采用MTT法检测KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞存活率的影响,观察巨噬细胞形态的变化;采用吞噬中性红和流式细胞仪测FITC-dextran的方法检测KGM处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性;采用Griess法测定NO,ELISA法检测细胞培养液中IL-6,IL-1β和TNF-α等细胞因子的含量;采用qRT-PCR法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7相关基因iNOS,IL-6,TNF-α,IL-1β,TLR4,My D88,TRAF-6,TRAM和NF-κB等的表达。结果 KGM在50～400 mg·L~(-1)对小鼠巨噬细胞RAW264.7没有细胞毒性。KGM处理24 h后,RAW264.7细胞体积增大,胞内颗粒小泡增多,呈不规则多边形,部分细胞伸出伪足,表现为典型的激活态;中性红吞噬实验和流式测定FITC-dextran实验结果表明,KGM 50～200 mg·L~(-1)能显著提升小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性,与对照组相比,KGM 100 mg·L~(-1)分别使细胞吞噬活性提高101.4%和404.3%。Griess法检测表明,KGM能显著增加小鼠巨噬细胞RAW264.7合成和释放NO,其中KGM100 mg·L~(-1)处理组细胞NO含量与LPS 5 mg·L~(-1)作用相当,与对照组相比,NO含量提高318.1%。ELISA检测表明,KGM 50～200 mg·L~(-1)能诱导RAW264.7细胞分泌IL-6,TNF-α和IL-1β等细胞因子,与对照组相比,KGM 100 mg·L~(-1)明显使细胞因子分泌量分别增加415.5%,158.6%和458.0%(P<0.01)。qRT-PCR的结果显示,与对照组相比,KGM组IL-6,i NOS,TNF-α,IL-1β,TLR4,My D88,TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平升高(P<0.05),表明KGM可以激活小鼠巨噬细胞RAW264.7中的核转录因子NF-κB和TLR4。结论 KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞具有免疫调节活性,能够显著提升小鼠细胞RAW264.7的吞噬能力,促进分泌与释放NO和TNF-α等相关细胞因子,推测可能是通过激活TLR4/My D88/NF-κB信号通路发挥免疫调节作用。     

采用正负离子切换模式的LC-ESI-MS/MS法测定大鼠灌胃给药后京尼平苷的血浆浓度(英文)

建立了一种快速、专属性强的液相色谱-串联质谱方法(LC-MS/MS)测定中药栀子的主要活性成分–京尼平苷的大鼠血药浓度去评价其临床前药动学特征。京尼平苷血浆样品经沉淀蛋白后,采用DiamonsilC18色谱柱进行分析,采用流动相10mM醋酸铵–甲醇(20:80,v/v),流速0.6mL/min。样品测定采用"Truncated"多反应检测模式,采用正离子m/z411→411测定京尼平苷,采用负离子m/z415→295测定内标葛根素。线性浓度范围为10.0–5000ng/mL,最低定量下限为10.0ng/mL,样品提取回收率范围为84.8%–90.5%。该确证方法成功应用于大鼠灌胃(给药剂量200mg/kg)给予京尼平苷后的药动学研究。     

产地加工对杜仲京尼平苷酸含量的影响

目的：比较不同加工方法对杜仲京尼平苷酸含量的影响,为杜仲的合理化产地加工提供科学依据。方法采用高效液相色谱法测定京尼平苷酸量。结果不同加工方法对杜仲京尼平苷酸含量有影响。同一干燥方法,未发汗杜仲京尼平苷酸量高于发汗杜仲;同一性状,烘干、晒干与阴干三者间京尼平苷酸量存在显著差异,以80℃烘干含量最高;不同性状,80℃烘干京尼平苷酸量无显著差异。结论临床应用如以京尼平苷酸的生物活性为主,结合实际生产,建议杜仲采用趁鲜切宽丝,不发汗,80℃烘干的产地加工方法。     

中药赤芍抗内毒素活性的实验观察

目的：通过提取中药赤芍中抗内毒素（LPS）活性的有效成分,进行药理学观察,探讨赤芍抗内毒素活性的内在机制。方法：将常规中药化学分离技术与生物传感器相结合,分离赤芍抗LPS的有效成分,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和鲎试验法检测该有效成分对LPS的中和作用。结果：赤芍中抗LPS的有效成分具有较强的中和LPS的活性．该有效成分能够在体外实验中显著抑制由LPS介导的培养细胞系释放TNF-α。结论：中药赤芍中存在高活性的抗LPS有效成分．该成分可以LPS为靶点,应用常规中药化学分离技术与生物传感器相结合的方法进行快速、有效地提取分离。     

复方积雪草有效组分干预肾小管上皮细胞Toll样受体4表达的实验研究

目的：探讨复方积雪草有效组分-积雪草苷／大黄素干预肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导的小鼠肾小管上皮细胞（mTEC）Toll样受体4（TLR4）mRNA及蛋白的表达水平。方法：采用mTEC,模型组用TNF—α 5ng／mL诱导,治疗组在TNF-α诱导的同时,以不同浓度的积雪草苷合大黄素进行干预,于24h后分别提取细胞RNA及上清,应用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术（FCM）分别检测mTEC TLR4 mRNA和膜蛋白的表达。结果：正常mTEC具有TLR4 mRNA和蛋白表达,经TNF-α诱导后TLR4表达明显上调,当积雪草苷合大黄素干预浓度达4ug／mL＋0．4ug／mL时,能够抑制TLR4 mRNA及蛋白的表达水平。结论：复方积雪草有效组分能够抑制TNF-α上调所致的肾小管上皮细胞TLR4过度表达,从而缓解肾脏局部失控性炎症反应。     

诃子抗CPG ODN组分的分离及活性评价

目的：从诃子中分离制备具有拮抗CPGODN作用的活性组分。方法：应用水提、离子色谱技术等方法，从诃子中分离制备具有拮抗CPGODN活性的组分；并应用生物传感器技术，对所得到的组分进行与CPGODN结合活性的筛选；观察其对CPGODN刺激的小鼠RAW264.7细胞释放炎症介质的抑制作用。结果：应用生物传感器技术筛选出与CPGODN结合活性最高的诃子作为研究对象，应用离子色谱技术从诃子中分离出3组分，其中有3个组分均具有一定的与Lipid A的结合活性，以第3组分与Lipid A的结合活性最强；并对CPGODN刺激的小鼠RAW264．7细胞释放TNF-α具有显著的抑制作用；结论：从诃子中分离出的第3组分具有显著的拮抗CPGODN活性。