壳聚糖-藻酸盐多通道支架材料细胞相容性研究

[目的]通过体外细胞毒性试验,细胞与支架材料复合培养实验和体内植入试验,评价壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞相容性。[方法]通过冷冻干燥法制备具有纵行、平行排列通道的壳聚糖-藻酸盐支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromalcell,BMSCs)与其浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5d时支架材料的细胞毒性。在体外将BMSCs与壳聚糖-藻酸盐支架材料复合培养3、5、7d后行扫描电镜检测,并将其植入急性脊髓半横断损伤模型中,6周后行免疫荧光检测BMSCs在材料中的生长与分化情况。[结果]MTT法检测示壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞毒性为0-1级。扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养3d后即可粘附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后6周,Neurofilament200、NSE免疫荧光检测证实,支架材料内有大量BMSCs存活,部分向神经元样细胞分化。[结论]壳聚糖-藻酸盐支架具有良好的细胞相容性,有望成为一种较理想的神经组织工程支架材料。     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠BMSCs增殖和分化的影响,探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,取第5代细胞制备胶原凝胶-BMSCs复合体。采用扫描电镜、HE染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态;MTT检测该支架对BMSCs增殖的影响。取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性(GFP~+)BMSCs于胶原凝胶支架中培养24 h,通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示,GFP~+BMSCs均匀分布于胶原凝胶支架内,大部分GFP~+BMSCs呈梭形,部分细胞伸出突起,部分细胞间形成连接,提示BMSCs在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构,BMSCs可黏附于该支架材料上,细胞形态良好。MTT检测示,BMSCs于胶原凝胶支架中培养后3、5、7 d的吸光度(A)值均高于单纯BMSCs培养,其中5、7 d时组间差异有统计学意义(t=4.472,P=0.011;t=4.819,P=0.009)。HE染色示,胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs在胶原凝胶内培养24 h后均匀分布其中;7 d时BMSCs形态多样,部分细胞伸出细长突起,具有体外培养的神经元样形态。结论胶原凝胶支架制备简便,具有良好的生物相容性,可作为神经组织工程支架材料。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨软骨的实验研究

目的 :对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙及生长因子复合形成的组织工程性骨软骨进行形态学观察。方法 :以可注射性藻酸钙凝胶作为细胞载体 ,将体外扩增的BMSCs和生长因子IGF Ⅰ、TGF β分为 5种组合 ,注射于自体新西兰白兔皮下 ,分期取材观察。结果 :藻酸钙凝胶复合BMSCs及IGF Ⅰ和TGF β能在皮下形成软骨组织 ,逐渐转化为骨组织并最终被吸收 ,无免疫排斥及毒性反应。结论 :BMSCs 藻酸钙 生长因子复合材料能形成软骨及骨组织。藻酸钙适合BMSCs生长 ,是一种良好的软骨组织工程载体。     

无定形磷酸钙负载rhBMP-2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验

[目的]制备无定形磷酸钙（ACP）负载重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2／ACP）纳米缓释体并观察其细胞毒性，为进一步体内植入提供实验依据。[方法]采用湿化学法合成rhBMP-2／ACP纳米缓释体；兔间充质干细胞（BMSCs）与rhBMP-2／ACP纳米缓释体进行体外复合培养，观察细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达，检测材料的细胞毒性。[结果]材料浸提液对兔BMSCs的生长无影响，其细胞相对增殖率在100．2％～102．5％之间，细胞毒性评级为0级；BMSCs于复合材料表面的黏附、生长速度、形态与对照组无明显差别。[结论]rhBMP-2／ACP纳米缓释体无细胞毒性，复合培养不影响BMSCs的正常生理功能，细胞相容性良好。     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

hTGF-β1基因修饰BMSCs复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化软骨

目的 探讨hTGF-β1转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化软骨的可行性. 方法 全骨髓法获取和培养大鼠BMSCs,取第3代细胞接种于细胞培养板.实验分成3组:Ad-hTGF-β1转染组、Ad-EGFP转染组、空白对照组,前两组分别加入含Ad-hTGF-β1与Ad-EGFP的无血清培养基,空白对照组添加不做任何处理的完全培养基.7d后,运用实时荧光定量PCR与Western blot检测TGF-β1的表达情况.将Ad-hTGF-β1成功转染组的BMSCs继续大量扩增后.按照1.0×107/ml的细胞密度制成细胞—藻酸钙凝胶复合物,将复合物置于培养箱中继续体外培养.10d后,观察凝胶材料中的细胞形态与增殖情况,并将复合物包埋、切片,进行组织学及免疫组织化学染色分析软骨分化情况. 结果 转染后7d,实时荧光定量PCR结果显示TGF-β1表达量的平均相对比值Ad-hTGF-β1转染组(0.863)明显高于Ad-EGFP转染组(0.183)、空白对照组(0.180),差异有统计学意义(P＜0.05).Westem blot检测发现Ad-hTGF-β1转染组的细胞内TGF-β1表达呈强阳性,而Ad-EGFP转染组及空白对照组细胞内的TGF-β1表达很弱.倒置显微镜观察到细胞在藻酸钙凝胶中能够很好的维持球形生长;MTr检测显示,不同时间点细胞在藻酸钙凝胶中的数量变化差异无统计学意义(P＞0.05).HE染色可见有大量软骨陷窝形成,甲苯胺蓝、Masson染色可见有软骨基质分泌,CollagenⅡ免疫组织化学染色呈阳性表达. 结论 hTGF-β1成功转染的BMSCs,在藻酸钙凝胶材料中培养在维持细胞形态的同时能够很好的向软骨细胞分化,此种培养方法更能模拟细胞在体内的生长方式.     

异体冻干颗粒骨复合骨髓基质干细胞源性成骨细胞体外生物相容性研究

[目的]评价异体冻干颗粒骨体外生物相容性,为其作为骨组织工程支架材料的临床应用提供实验依据。[方法]4周龄SD大鼠,雌雄不限,采用全骨髓贴壁法体外培养骨髓基质干细胞(BMSCs),取生长状态良好的第3代BMSCs行成骨诱导培养并鉴定。制备异体冻干颗粒骨浸提液,将成骨诱导7d的BMSCs加入浸提液作为实验组,未加浸提液的为对照组,培养1、3、5d,采用MTT法检测异体冻干颗粒骨浸提液对细胞增殖的影响。成骨诱导7d的BMSCs按1×106/ml接种于异体冻干颗粒骨上,倒置相差显微镜、扫描电镜观察与其复合培养的细胞在材料上的生长情况;酶消化法消化复合于冻干颗粒骨上的成骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化。[结果]BMSCs成骨诱导7d,ALP染色示胞浆内可见阳性蓝染颗粒,胞核呈红色。MTT法检测结果显示细胞在浸提液中生长与增殖状态良好,实验组与对照组差异无统计学意义(P0.05);倒置相差显微镜可见颗粒骨表面粘附多数成骨细胞;扫描电镜观察可见细胞在材料表面粘附、伸展并能增殖、分泌产生细胞外基质;流式细胞术检测显示,异体颗粒骨对细胞周期无影响,实验组细胞均为正常2倍体细胞。实验组与对照组差异无统计学意义(P0.05)。[结论]异体冻干颗粒骨无细胞毒性并具有良好的组织细胞相容性,为其临床应用提供了实验依据。     

骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性研究

[目的]研究骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性,进一步探讨联合二者移植修复脊髓损伤可能性.[方法]采用改良化学方法制备去细胞肌肉生物支架并复合冷灭菌方法灭菌,密度梯度离心法体外分离、贴壁法培养BMSCs,注射法接种第3代细胞于支架.[结果]H-E常规染色观察支架内部呈平行走行,Masson染色示支架内平行结构主要为胶原纤维,几乎没有肌纤维.接种BMSCs于支架并孵育14 d后,Hoechest 33342荧光标记计数显示大量存活细胞,扫描电镜可见细胞贴附于支架内表面生长.[结论]去细胞肌肉生物支架具有规则的内部结构是细胞移植理想载体.BMSCs能与去细胞肌肉生物支架体外相容并存活至少2周,为进一步体内联合移植修复脊髓损伤提供实验支持.