成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞血液血管干细胞特性观察

目的:检测脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞是否具有血液血管干细胞的特性.方法:将脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞分别于血管内皮及造血细胞诱导培养体系中培养,采用RT-PCR、免疫组织化学方法检测分析其生物学特性.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在内皮细胞诱导体系中可分化为CD31 /vWF 细胞,在基底膜胶中可形成血管样结构;在造血诱导培养体系中可定向分化为表达GATA-1、GATA-2、β及γ珠蛋白的细胞,在甲基纤维素造血培养基中,这类造血细胞可定向分化为红系集落单位.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在体外可同时向血管内皮细胞和造血细胞分化,具有血液血管干细胞的特性.     

异基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞小鼠移植后嵌合体形成及免疫耐受检测

目的:探讨器官移植中脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性.方法:20只C57BL/6小鼠经致死量射线照射后随机等分为2组,实验组移植C57BL/6小鼠骨髓细胞和BALB/c小鼠脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,对照组仅移植C57BL/6小鼠骨髓细胞,以CM-DiI荧光染料示踪脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的体内分布情况,并以PCR方法检测Y染色体的存在以进一步鉴定.以皮肤移植实验观察脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植小鼠对供体来源组织器官移植物的反应性,以未移植Flk1 CD31-CD34-细胞小鼠为对照.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞可进入并较长期(30 d)存在于异基因小鼠免疫器官内;在细胞移植组小鼠脾脏组织中可检测到供体来源T细胞占受体脾细胞的6.68%;脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠供体来源皮肤移植物存活＞90 d,未处理组为8～9 d.结论:异基因脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌和体,并诱导特异性免疫耐受的产生.     

重建端粒酶活性对成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞寿命及其成骨细胞潜能的影响

目的:观察重建端粒酶活性对成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的寿命及成骨潜能的影响.方法:将人端粒酶催化亚基(hTERT)基因通过脂质体转染法导入成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,RT-PCR检测转染细胞hTERT mRNA的表达,TRAP-PCR检测细胞端粒酶活性.Von-Kossa染色及RT-PCR检测已重建端粒酶活性的脂肪源细胞向成骨细胞分化的潜能.结果:转染hTERT的成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞能稳定表达端粒酶活性.转染后第75代的细胞仍维持着自我更新及向成骨细胞分化的潜能,且无恶性转化倾向.结论:重建端粒酶活性可延长成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞寿命,并维持其自我更新及成骨潜能.     

非肥胖型糖尿病及严重联合免疫缺陷小鼠体内成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞的多向分化

目的:探讨成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞用于移植的可能性.方法:将男性成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞按106个/只剂量经尾静脉输入10只6～8周龄、接受亚致死剂量射线照射的非肥胖型糖尿病及严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内(实验组),对照组10只输注等体积的RPMI 1640培养基,2个月后处死动物,检测植入情况.结果:在实验组小鼠体内,脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞不仅有助于造血重建及体内微血管损伤的修复,参与血管新生,还能分化为消化道上皮细胞;而对照组小鼠则在2周内全部死亡.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞极有可能成为一种理想的种子细胞用于移植.     

成人多组织器官中胚胎后亚全能干细胞的分离与鉴定

目的:探讨成人多种组织中是否存在胚胎后亚全能干细胞.方法:用免疫磁珠从成人的多种组织中分离到CD105 细胞后,通过极限稀释法获得单克隆细胞,体外扩增并鉴定其生物学特性.结果:从成人的多种组织中分离得到的单克隆源细胞体外已传35代,免疫表型与脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞一致,即Flk1及CD44阳性,而CD31、CD34、CD45、HLAⅠ类抗原及 HLA-DR 阴性;细胞形态与脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞相似,呈成纤维样;在对数生长期,细胞倍增时间也与脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞一致,约为30 h;体外可被定向诱导为在细胞形态及表型上与脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞及肝上皮样细胞一致的细胞.结论:人体多种组织中均存在胚胎后亚全能干细胞,可用胚胎后亚全能干细胞学说来解释干细胞的可塑性.     

异基因脂肪源Flk1^＋CD31^-CD34^-细胞移植后形成稳定的嵌合体并诱导免疫耐受

目的研究器官移植中脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性。方法以CM-D iI荧光染料示踪脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞的体内分布情况,并以PCR方法检测Y染色体的存在以进一步鉴定;以皮肤移植实验观察脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠对供者来源组织器官移植物的反应性。结果脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞可进入并较长期(30d)存在于异基因小鼠免疫器官内;在细胞移植组小鼠脾脏中可检测到供者来源T细胞占受者脾细胞的6.68%;脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠供者来源皮肤移植物存活(90d,未处理组平均为10d。结论异基因脂肪源F lk1 CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌合体,并诱导特异性免疫耐受的产生。     

小鼠脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞促造血恢复作用观察

目的:观察小鼠成体脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞体内外能否促进造血恢复.方法:用小鼠脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞作滋养层,接种造血细胞,观察培养后1～4周造血细胞数及粒-巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)的变化,并设对照组.30只经137Cs全身照射0.35 Gy的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,空白对照组尾静脉注射生理盐水,对照组注射骨髓有核细胞,实验组注射骨髓有核细胞及脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,注射后均检测外周血和骨髓有核细胞数及CFU-GM变化,PCR检测受体小鼠体内Y染色体的表达.结果:体外实验中实验组接种后2～4周造血细胞数均高于对照组(P均＜0.05),接种后1～4周CFU-GM值均高于对照组(P均＜0.05);体内实验中空白对照组小鼠移植后10 d左右死亡,实验组小鼠外周血和骨髓有核细胞数、CFU-GM从第2周起均高于对照组(P均＜0.05),第4周实验组小鼠骨髓细胞有Y染色体表达.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞能促进小鼠造血恢复.     

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞（hADSCs）,并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glut-2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glut-2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。     

GLP-1(7-36)NH2对新生大鼠胰岛祖细胞的诱导分化作用

目的:观察GLP-1(7-36)NH2对新生大鼠胰岛祖细胞的诱导分化作用.方法:从新生大鼠胰岛中分离培养胰岛祖细胞,用含20 nmol/L GLP-1(7-36)NH2的RPMI 1640完全培养基诱导分化4周(GLP-1组,n=5),以RP-MI1640完全培养基作对照(n=5).免疫细胞化学染色检测诱导分化前后细胞Nestin、PDX-1、胰岛素、生长抑素的表达;放射免疫法测定每周末培养基中胰岛素含量(胰岛素分泌量);二硫腙染色观察形成的胰岛样细胞团(ICCs),4周后计数每25 cm2中直径＞50 μm的ICCs数目.结果:诱导前胰岛祖细胞不表达PDX-1、胰岛素、生长抑素,仅表达Nestin.诱导4周后,GLP-1组PDX-1、胰岛素、生长抑素表达阳性率和ICCs计数均高于对照组(P＜0.05).GLP-1组诱导3周、4周后胰岛素分泌量高于对照组(P＜0.05).结论:GLP-1(7-36)NH2可以促进胰岛祖细胞分化成熟,形成有胰岛素分泌功能的ICCs.     

异体脂肪源间充质干细胞移植后稳定嵌合体的形成及免疫耐受的诱导

目的研究器官移植中脂肪源F1k1＋CD31—CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性。方法以CM—DiI荧光染料示踪脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞的体内分布情况，并以PCR方法检测Y染色体的存在以进-步鉴定；以皮肤移植实验观察脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞移植组小鼠对供者来源组织器官移植物的反应性。结果脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞可进入并较长期（30d）存在于异基因小鼠免疫器官内；在细胞移植组小鼠脾脏中可检测到供者来源T细胞，占受者脾细胞6．68％；脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞移植组小鼠供者来源皮肤移植物存活〉90d，未处理组平均为10d。结论异基因脂肪源F1k1＋CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌和体，并诱导特异性免疫耐受的产生。     

体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素生成细胞团

目的探讨体外联合应用激活素A、全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺4种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导分化为胰岛素生成细胞团。方法先后以激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子诱导小鼠ESC 14 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫荧光检测分化细胞胰岛素表达。结果分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和免疫荧光染色阳性。结论体外联合应用激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子能够将小鼠ESC诱导分化为胰岛素生成细胞团。