下调HOXA5表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响

目的 探讨下调同源异型盒基因A5（HOXA5）表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法 应用生信分析方法,计算机检索CGGA数据库,下载mRNAseq-693和mRNAseq-325芯片数据,获取低级别胶质瘤（WHO分级Ⅱ级）和高级别胶质瘤（WHO分级Ⅲ、Ⅳ级）HOXA5 mRNA表达及病人生存信息;以HOXA5表达水平的平均值为界限,将高级别胶质瘤分为低表达组和高表达组。体外培养人胶质瘤细胞株U87和U251,使用Lipofectamine 2000法将HOXA5 siRNAs和阴性对照siRNAs分别转染U87和U251细胞;CCK-8和平板克隆形成实验评估胶质瘤细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果 生信分析结果显示:高级别胶质瘤HOXA5表达水平均显著高于低级别胶质瘤（P<0.01）;HOXA5高表达组高级别胶质瘤病人中位生存时间较低表达组明显缩短（P<0.01）。体外细胞实验结果:敲低HOXA5表达,U87和U251细胞的增殖率和克隆集落数量显著降低（P<0.01）,U87和U251细胞G0/G1期细胞百分比显著增高（P<0.01）,U87和U251细胞CDK4蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。结论 胶质瘤HOXA5呈高表达,病理级别越高,表达水平越高,病人生存预后越差。敲低HOXA5表达,明显降低CDK4表达,使细胞周期停滞在G0期,明显抑制胶质瘤细胞的增殖。     

过表达TBX2对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨TBX2表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法 采用RT-qPCR和免疫印迹法检测53例胶质瘤组织和瘤旁组织TBX2mRNA和蛋白表达水平。体外培养胶质瘤细胞（U251、U87和SHG-44）和正常星型胶质细胞（HA1800）,采用RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平。构建TBX2过表达或低表达U251细胞株,分别采用WST-1法检测胶质瘤细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 胶质瘤组织TBX2 mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁组织（P<0.05）,而且,高级别胶质瘤TBX2表达水平显著高于低级别胶质瘤（P<0.05）。相比于人正常星型胶质细胞系HA1800,胶质瘤细胞系U251、U87、SHG-44细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）;而且,U251细胞TBX2表达水平显著高于U87和SHG-44细胞（P<0.05）,因此使用U251细胞进行后续实验。过表达TBX2显著增加U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）,低表达TBX2显著抑制U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）。结论 胶质瘤TBX2呈高表达,与胶质瘤增殖、侵袭能力有关。     

IDH1 R132H突变对不同级别胶质瘤的影响及相关因素分析

目的检测人脑不同级别胶质瘤组织中IDH1 R132H突变及胶质瘤细胞系IDH1表达情况,探讨IDH1 R132H突变对不同级别胶质瘤的影响。方法采用q-PCR法检测U87、U251、LN-229、HS683、U118等胶质瘤细胞系中IDH1表达情况,回顾性收集70例经手术切除、病理确诊的胶质瘤组织标本(实验组)及同期因脑外伤行颅内减压术留取的脑组织标本20例(对照组),采用免疫组化法、Western blot法检测IDH1 R132H突变情况,所得数据采用SNK法或K-W检验,分类变量采用χ²检验,生存分析比较预后情况。结果IDH1在U87、HS683中相对表达较高,在U251、U118、LN-229中相对低表达;70例人脑胶质瘤组织标本中36例(51.4%)突变,突变主要发生在Ⅱ(51.7%)、Ⅲ(79.2%)级胶质瘤及星形胶质细胞瘤中(80.0%),差异有统计学意义(P<0.05);胶质瘤组织IDH1 R132H突变与患者年龄、癫痫发作、病理级别、Ki-67表达有关(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ胶质瘤患者中IDH1 R132H的预后较好(P<0.05),Ⅳ级胶质瘤患者中IDH1 R132H与预后无明显相关性(P=0.72)。结论IDH1在U87、HS683细胞系中相对高表达,为胶质瘤发生机制的研究提供了较好的细胞模型。IDH1 R132H突变多发生在Ⅱ、Ⅲ级星形胶质细胞瘤患者中,且突变与患者年龄、癫痫发作、病理级别、Ki-67表达有关;IDH1 R132H突变的Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤患者预后好于未突变的患者。     

Notch1通路与胶质瘤细胞管道形成能力相关性研究

目的探索胶质瘤细胞来源的管道(glioma clls derived vessels,GCDV)的形成机制。方法将胶质瘤细胞株U87、U251、U373、SF295、T98G、SKMG-4和C6进行体外三维培养,观察其管道形成能力。Western blot检测各个胶质瘤细胞株Notch1、Dll4蛋白的表达情况。结果三维培养C6细胞单个视野下(100×)的平均管道数(25.2±5.0)个,U373为(36.4±3.20)个,U87为(19.0±2.2)个,T98G为(12.6±2.4)个,SF295为(4.0±2.)个,U251为(0.2±0.4)个,SKMG-4为0。Notch1在U87、U251、T98G、SF295、SKMG-4、C6、U373表达相关密度分别为0.34、0.21、0.79、0.04、0.28、1.75、1.19,与管道形成能力显著相关(r=0.778,P=0.019);Dll4表达相关密度与管道形成能力不相关(r=0.635,P=0.062)。结论 Notch1蛋白表达与细胞株管道形成能力密切相关,而Dll4蛋白的表达与细胞株管道形成能力有待进一步探索。     

下调RNA甲基化酶NSUN2表达对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 探讨下调NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NSUN2)表达对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法体外培养正常胶质细胞HEB、胶质瘤细胞系（A172、U251、U87）,免疫印迹法检测NSUN2蛋白表达水平;用shNSUN2慢病毒（sh-NSUN2组）及shRNA scramble慢病毒（sh-CON组）感染U87细胞下调NSUN2表达,用CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移。结果 与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系A172、U251、U87的NSUN2蛋白表达量均明显增高（P<0.05）。与sh-CON组比较,sh-NSUN2组NSUN2蛋白表达水平、细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 胶质瘤NSUN2呈高表达,下调其表达明显抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。     

胶质瘤细胞系A172、U251、U87和SHG-44中HER2的表达及意义

目的 探讨人表皮生长因子受体2(HER2)在人神经胶质瘤细胞系A172、U251、U87和SHG-44中的表达情况.方法 采用Western blot 和流式细胞术(FCM)于蛋白质水平检测HER2在四种人胶质瘤细胞系中的表达.结果 Western blot检测出HER2在人胶质瘤细胞系A172中的表达量最高,U251次之,U87和SHG-44表达量较低.FCM检测结果显示HER2在A172、U251、U87和SHG-44中的阳性率分别为36.5%、21.5%、3.3%和3.5%.结论 人胶质瘤细胞系A172和U251中HER2的表达量较高,这两种细胞系可作为良好的细胞模型来研究HER2分子在胶质瘤中的作用机制以及以HER2为靶点的生物治疗等.     

STIP1对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）表达对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，及其对JAK2/STAT3信号通路的调控作用。方法 免疫印迹法检测体外培养的正常胶质细胞（SVG）和人胶质瘤细胞（U251、U87和U37）STIP1蛋白表达水平。NC-siRNA或STIP1-siRNA质粒转染U251细胞，CCK-8法检测U251细胞增殖；Transwell实验检测U251细胞侵袭能力；流式细胞术检测U251细胞凋亡率；免疫印迹法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平。结果 与正常胶质细胞SVG比较，胶质瘤细胞U251、U87和U373的STIP1蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较，STIP1-siRNA组STIP1蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞侵袭力明显明显降低（P<0.05），细胞凋亡率明显增高（P<0.05），而且，p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 STIP1在胶质瘤细胞中呈高表达，抑制STIP1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭、促进凋亡，机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

DLC1基因在人脑胶质瘤组织中的表达

目的 探讨抑癌基因DLC1在人脑胶质瘤组织中的表达和功能.方法 收集广州医学院第二附属医院神经外科自2007年1月至2009年6月手术切除的胶质瘤标本39例及同期行颅脑减压术治疗的颅脑损伤患者的正常脑组织10例,实时荧光定量PCR检测DLC1 mRNA的表达;将质粒pCS2-DLC1转染体外常规培养的人胶质瘤细胞株U251,同时用空载体pCS2-MT转染作为对照组,转染后36 h应用Western blot检测DLC1表达标签蛋白Mvc,应用MTT检测U251细胞增殖能力的变化.结果实时荧光定量PCR结果显示胶质瘤组织中DLC1 mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000),且Ⅰ级胶质瘤组织DLC1 mRNA的表达水平高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,差异有统计学意义(平均秩次分别为44.20、30.23、32.25、31.0,H=18.818,P=0.001);Western blot检测结果显示DLC1标签蛋白Mvc在pCS2-DLCI转染组细胞呈过表达,在pCS2-MT转染组细胞无明显表达;MTT检测显示pCS2-DLC1转染组U251细胞吸光度值高于pCS2-MT转染组,差异有统计学意义(P=0.002).结论 高表达的DLC1可能促进胶质瘤的形成和发展.     

miR-106a抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡

目的胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有较高的病死率。现有的研究表明miR-106a在多种肿瘤中表达上调,并发挥着致癌性作用,但miR-106a在胶质瘤中的表达和作用却并不清楚。方法不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系(T98G,SHG44,U87,U251,U373)内的miR-106a水平通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定。转染miRNA寡聚核苷酸后的U87和U251细胞的增殖能力和细胞周期分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪测定,并且通过膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V/PI)双染法测定了miR-106a对胶质瘤细胞的凋亡影响。结果miR-106a在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系内表达水平相对正常脑组织显著下降,并且miR-106a表达水平与胶质瘤病理级别负相关。胶质瘤细胞转染miR-106a后,可检测到过表达的miR-106a可显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力,阻滞细胞周期于G0/G1期,同时诱导胶质瘤细胞凋亡增加。结论 miR-106a可阻滞胶质瘤细胞细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡。     

钙蛋白酶-1在胶质瘤组织中的表达及其对U87细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨钙蛋白酶-1在人脑胶质瘤组织中的表达及其对U87胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法 收集2015年1月至2018年3月手术切除的胶质瘤组织和瘤旁正常脑组织各57例。体外培养U87细胞，将阴性对照小干扰RNA（NC组）和钙蛋白酶-1小干扰RNA（钙蛋白酶-1组）转染至人胶质瘤细胞株U87，以未转染的U87细胞为对照组。采用RT-PCR和免疫印迹法检测mRNA和蛋白表达水平，Transwell实验检测U87细胞侵袭能力，划痕实验评估U87细胞迁移能力。结果 胶质瘤组织钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平均显著高于瘤旁正常脑组织（P<0.05）。钙蛋白酶-1组U87细胞钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平、细胞侵袭数目、细胞迁移率以及转化生长因子-β、基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9 mRNA表达水平均明显低于对照组和NC组（P<0.05），而对照组和NC组均无统计学差异（P>0.05）。结论 钙蛋白酶-1在人脑胶质瘤中表达升高，而抑制钙蛋白酶-1表达可能通过影响上皮间质转化，抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移。     

过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂及其受体在胶质瘤中的表达

目的 研究人脑胶质瘤组织中尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA)及其受体（uPAR)的表达,探讨uPA、uPAR的表达与人脑胶质瘤恶性程度的关系。方法 采用半定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）方法,对49例人脑胶质瘤手术切除标本、U251等3株胶质瘤细胞,12例内减压术中切除的正常脑组织标本的uPA mRNA和uPAR mRNA表达水平进行检测。结果 随着胶质瘤恶性度的升高,其uPA及uPAR mRNA表达率和表达水平逐渐增高。U251等3株胶质瘤细胞也表达了较高水平的uPA及uPAR mRNA,而正常组织表达率及表达水平极低。结论 人脑胶质瘤中纤溶酶原激活系统活性较高,uPA、uPAR基因的高表达反映了胶质瘤的恶性生物学行为。     

The Effect of Hyaluronic Acid on the Invasiveness of Malignant Glioma Cells : Comparison of Invasion Potential at Hyaluronic Acid Hydrogel and Matrigel

Objective

Hyaluronidase (HAse), a degrading enzyme of hyaluronic acid (HA), is highly expressed in patients with malignant glioma. The purpose of this study was to verify whether HAse is related to the invasion of glioma cells. We also investigated if glioma cells with higher mobility in 2-dimensioal (2-D) method have also higher mobility at 3-dimensional (3-D) environment.

Methods

Malignant glioma cell lines (U87MG, U251MG, U343MG-A, and U373MG) were used, and their HAse expressions were evaluated by HA zymography. The migration ability was evaluated by simple scratch technique. The invasiveness of each cell lines was evaluated by Matrigel invasion assay and HA hydrogel invasion assay. In HA hydrogel invasion assay, colonies larger than 150 µm were regarded as positive ones and counted. Statistical analysis of migration ability and invasion properties of each cell lines was performed using t-test.

Results

In scratch test to examine migration ability of each cell lines, U87MG cells were most motile than others, and U343MG-A least motile. The HAse was expressed in U251MG and U343MG-A cell lines. However, U87MG and U373MG cell lines did not express HAse activity. In Matrigel invasion assay, the cell lines expressing HAse (U251MG and U343MG-A) were more invasive in the presence of HA than HAse deficient cell lines (U87MG and U373MG). In HA hydrogel invasion assay, the HAse-expressing cell lines formed colonies more invasively than HAse-deficient ones.

Conclusion

Malignant Glioma cells expressing HAse were more invasive than HAse-deficient ones in 3-dimensional environment. Therefore, it might be suggested that invasion of malignant gliomas is suppressed by inhibition of HAse expression or HA secretion. Additionally, the ability of 2-D migration and 3-D invasion might not be always coincident to each other in malignant glioma cells.     

人脑胶质瘤细胞系miRNA表达谱初步研究

目的 确定部分人脑胶质瘤细胞系miRNA表达谱的初步特征.方法 提取人脑胶质母细胞瘤细胞系U251、TJ861、TJ905、TJ899和A172以及星形细胞瘤细胞系H4细胞的miRNA,miRNA微阵列芯片杂交,扫描后分析差异表达的miRNA.选择差异表达的miR-21设计反义寡核苷酸处理U251细胞后原位杂交和Western blot检查SEPT 7的表达.结果 在胶质瘤细胞系中hsa-miR-21等8种miRNA一致表达上调;hsa-miR-1等18种miRNA一致表达下调.miR-21锁核酸修饰反义寡核苷酸处理U251细胞72h后,原位杂交发现阳性信号集中在细胞核的miR-21表达显著下降,Western blot发现U251细胞中SEPT 7的表达明显上调.结论 miRNA的差异表达可能是胶质瘤的重要分子生物学标签,并在基因表达调控中具有潜在的研究价值.     

Expression and function of water channels (aquaporins) in migrating malignant astrocytes

Aquaporins (AQP) constitute the principal pathway for water movement across biological membranes. Consequently, their expression and function is important for cell volume regulation. Glioma cells quickly adjust their cell volume in response to osmotic challenges or spontaneously as they invade into the narrow and tortuous extracellular spaces of the brain. These cell volume changes are likely to engage water movements across the cell membrane through AQP. AQP expression in glioma cells is poorly understood. In this study, we examined the expression of AQP in several commonly used human glioma cell lines (D54, D65, STTG1, U87, U251) and in numerous acute patient biopsies by PCR, Western blot, and immunocytochemistry and compared them to nonmalignant astrocytes and normal brain. All glioma patient biopsies expressed AQP1, AQP4 and some expressed AQP5. However, when isolated and grown as cell lines they lose all AQP proteins except a few cell lines that maintain expression of AQP1 (D65, U251, GBM62). Reintroducing either AQP1 or AQP4 stably into glioma cell lines allowed us to show that each AQP is sufficient to restore water permeability. Yet, only the presence of AQP1, but not AQP4, enhanced cell growth and migration, typical properties of gliomas, while AQP4 enhanced cell adhesion suggesting differential biological roles for AQP1 and AQP4 in glioma cell biology.     

RNA干扰敲低Wnt2的表达抑制U251细胞生长的体内外研究

目的 在体内外研究转染靶向Wnt2的siRNA对U251细胞的抑制效果.方法 向U251细胞转染靶向Wnt2的siRNA后,免疫印记检测转染后Wnt2及相关蛋白表达,MTT检测细胞增殖,annexin标记细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期分布,鼠尾胶3D生长实验检测细胞侵袭能力的变化.建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Wnt2 siRNA观察肿瘤生长情况.结果 转染Wnt2siRNA后,U251细胞的Wnt2、frizzled2、磷酸化GSK-3β、β-catenin等表达降低,细胞增殖受抑,凋亡率升高,细胞阻滞于G0/G1期.体内研究发现转染靶向Wnt2的siRNA后,裸鼠皮下肿瘤的生长速度缓慢,相应的蛋白表达降低.结论 转染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低该基因在U251细胞内的表达,从而抑制了胶质瘤细胞生长,具有潜在的治疗前景.     

促肾上腺皮质激素释放因子受体1在人脑胶质瘤中表达及其临床意义

目的探讨促肾上腺皮质激素释放因子受体1(CRFR1)在人脑胶质瘤中表达及其临床意义。方法随机收集35例临床手术切除胶质瘤组织标本及培养人类胶质母细胞瘤株U87,进行CRFR1免疫组化染色,以5例泌乳素垂体腺瘤组织标本作为阳性对照。检测胶质瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)表达。同时,分析CRFR1表达与临床病理因素之间的相关性。结果 CRFR1着色于肿瘤细胞膜,在不同类型、级别的脑胶质瘤中均有着色,且随肿瘤病理级别增高而表达增高,差异有统计学意义(P<0.05);胶质母细胞瘤中存在U87、CRFR1和PCNA高表达;CRFR1表达与患者KPS评分及PCNA表达有关。结论 CRFR1在胶质瘤细胞发生、增殖及侵袭性生长过程中可能扮演了重要角色,对胶质瘤恶性生物学特性的作用机制需要进一步探讨。     

NDRG2截断肽对胶质瘤细胞系U87MG和U251的抗肿瘤作用

目的探讨源于N-myc下游调节基因2(NDRG2)蛋白的截短肽对胶质瘤细胞系U87MG和U251的抗肿瘤作用。方法设计、构建人类NDRG2蛋白若干截短肽片段的真核表达载体,转染至上述两种肿瘤细胞中,通过流式细胞术(FCM)观察肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞情况。结果流式细胞术结果显示,包含NDRG2蛋白C末端的片段均能不同程度的诱导两种肿瘤细胞系的周期阻滞。结论 NDRG2的C末端是其抗肿瘤作用的关键,很有可能从中筛选出具有治疗意义的抗肿瘤肽。     

反义hTERT抑制恶性胶质瘤生长的体内外研究

目的 探讨腺病毒介导的反义hTERT在体内外对恶性胶质瘤细胞生长的影响.方法 构建含有hTERT反义序列的腺病毒载体在体内外转染恶性胶质瘤细胞系U251,检测肿瘤细胞生长情况、细胞周期变化、端粒酶活性、hTERT蛋白表达等.结果 腺病毒介导的hTERT反义治疗在体外明显抑制肫瘤细胞生长,增殖减慢,凋亡增多,细胞较多聚集在G1/G0期,转染后第6天细胞生存率为46.9%,端粒酶活性和hTERT蛋白表达都明显下降,在体内实验中肿瘤生长明显减慢.结论 腺病毒介导的反义hTERT在体内外能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长.