血管内皮-平滑肌细胞双层联合培养模型的改进

目的　建立并改进血管内皮和平滑肌细胞双层联合培养模型 ,为进一步研究血管内皮和平滑肌细胞间的信号传递奠定基础。方法　先分别单独培养大鼠主动脉血管内皮和平滑肌细胞 ,然后分别培养在聚乙烯细胞培养微孔滤膜两面 ,并以不同的比例重叠。结果　两种细胞重叠 1 3、2 3和 10 0 %,以孔径分别为 1 0或 3 0 μm微孔滤膜对两种细胞进行双层联合培养后 ,对内皮细胞的影响不明显 ,但对平滑肌细胞的影响则十分显著 ,细胞形态以“收缩型”为主 ,肌纤维增多 ,生长速度较单独培养时慢 ,形成单层贴壁细胞的时间延长 12～ 18h ,无明显“峰 谷”状态形成。结论　改进后的联合培养方法经济、简便 ,更适合于研究血管内皮和平滑肌细胞间的信号传递     

高糖对培养的肾小球系膜细胞产生t-PA及与其结合的影响

目的 观察高糖状态下系膜细胞与组织型纤溶酶原激活物（Tissue plasminogen,t-PA）结合力及系膜细胞产生t-PA活性改变与纤维连接蛋白（Fibromectin,FN）产生的影响。方法 采用体外人肾小球系膜细胞培养，放射性核素标记法测定系模细胞与t-PA结合力，纤维蛋白酶谱法检测t-PA活性，酶联免疫分析检测FN。结果 高糖可抑制系膜细胞与t-PA结合力，同时t-PA活性增加，FN产生明显增多，并随着培养时间的延长，葡萄糖愈高，作用愈明显。结论 高糖致系膜细胞与t-PA结合力下降，t-PA活性增加，同时可能其抑制物明显增多，导致细胞外基质积聚，可能是糖尿病肾小球坚硬是化发生的重要原因之一。     

内皮祖细胞定向分化平滑肌细胞的实验研究

目的内皮祖细胞是一种理论上非常合适的血管组织工程种子细胞,最终分化成成熟内皮细胞。实验拟证实内皮祖细胞可以定向分化成平滑肌细胞。方法以猪为实验动物,采集骨髓单核细胞,分离培养内皮祖细胞,然后应用血小板衍生生长因子(PDGF)BB诱导内皮祖细胞定向分化。通过免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞类型。结果经过诱导的内皮祖细胞定向分化成平滑肌细胞。未经诱导的细胞分化成内皮细胞。结论内皮祖细胞不仅可以分化成内皮细胞,而且可以在PDGF-BB作用下分化成平滑肌细胞,是一种理想的血管组织工程种子细胞来源。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

内皮祖细胞定向分化平滑肌细胞的实验研究

目的 内皮祖细胞是一种理论上非常合适的血管组织工程种子细胞,最终分化成成熟内皮细胞.实验拟证实内皮祖细胞可以定向分化成平滑肌细胞.方法 以猪为实验动物,采集骨髓单核细胞,分离培养内皮祖细胞,然后应用血小板衍生生长因子(PDGF)BB诱导内皮祖细胞定向分化.通过免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞类型.结果 经过诱导的内皮祖细胞定向分化成平滑肌细胞.未经诱导的细胞分化成内皮细胞.结论 内皮祖细胞不仅可以分化成内皮细胞,而且可以在PDGF-BB作用下分化成平滑肌细胞,是一种理想的血管组织工程种子细胞来源.     

小剂量茶碱对大鼠气道平滑肌细胞表达NF-κB与ICAM-1的影响

目的:观察小剂量茶碱对培养的大鼠气道平滑肌细胞表达核因子κB(NF-κB)与细胞间黏附分子1(ICAM-1)的影响,探讨小剂量茶碱在气道发挥抗炎作用的可能机制。方法:体外培养正常大鼠鼠婴的气道平滑肌细胞,将培养出的细胞随机分为3组:空白对照组、肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激组、茶碱干预组。采用免疫组织化学SP法检测经TNF-α刺激的大鼠的气道平滑肌细胞中加入不同浓度的茶碱共同培养4 h,以及加入同一浓度茶碱共同培养不同时间,NF-κB活性和ICAM-1表达的变化。结果:TNF-α刺激组与空白对照组的NF-κB活性和ICAM-1表达相比较,差异均有显著性(P<0.05)。经TNF-α刺激的大鼠的气道平滑肌细胞中加入5,10,15 mg/L的茶碱共同培养4 h,NF-κB活性和ICAM-1表达均有所下降。与TNF-α刺激组相比,5 mg/L组无统计学差异(P>0.05),余两组差异均有显著性(P<0.05)。且茶碱干预组内两两比较,差异均有显著性(P<0.05)。经TNF-α刺激的大鼠的气道平滑肌细胞中加入10 mg/L茶碱共同培养2,4,24 h。与TNF-α刺激组相比,茶碱处理组的差异均有显著性(P<0.05)。但茶碱处理组内不同处理时间两两比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:茶碱可能通过抑制气道平滑肌细胞NF-κB活性和ICAM-1的表达,进而减少炎症细胞在气道的浸润。     

坏死细胞释放IL-1对血管平滑肌细胞氧化应激的影响

目的 研究坏死细胞对正常血管平滑肌细胞氧化应激的影响及其主要作用因子.方法 体外培养的血管平滑肌细胞以无糖低氧条件诱导细胞坏死,收集坏死细胞培养上清液.体外培养且生长正常的血管平滑肌细胞根据不同的干预方式分为对照组(不予任何干预)、坏死上清组(NCS组,以坏死细胞培养上清液进行干预)和NCS+白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)组(NCS+IL-1RA组).对各组氧化应激指标细胞活性氧(ROS)生成以及培养细胞上清液中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性进行检测;RT-PCR和Western blotting检测各组细胞内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和氧化酶亚基p47phox mRNA和蛋白的表达.结果 与对照组比较,NCS组ROS生成和MDA含量明显增多(P＜0.05),SOD活性显著降低(P＜0.05);与NCS组比较,NCS+ IL-1 RA组ROS生成和MDA含量明显减少(P＜0.05),SOD活性显著升高(P＜0.05). RT-PCR和Western blotting检测结果显示:与对照组比较,NCS组和NCS+ IL-1RA组细胞中iNOS、cNOS和p47phox mRNA和蛋白的表达均显著上调(P＜0.05),且NCS+ IL-1RA组较NCS组显著下调(P＜0.05).结论 坏死细胞可诱导正常血管平滑肌细胞的氧化应激反应,抑制IL-1信号通路能减轻由坏死细胞引发的氧化应激反应.     

慢性哮喘肺组织组蛋白去乙酰化酶活性降低对气道平滑肌细胞表型转变的影响

目的 探讨慢性哮喘病理生理过程中肺组织组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性变化趋势及其对气道平滑肌细胞表型及生物学性状的影响。方法 构建慢性哮喘小鼠模型,检测肺组织HDAC活性。以HDAC抑制剂曲古霉素A(TSA)刺激体外培养的大鼠气管平滑肌及人原代支气管平滑肌细胞,采用蛋白质印迹、MTT、Transwell及三维凝胶收缩等方法检测抑制HDAC活性对气道平滑肌细胞表型转变的影响及其相应的细胞增殖、迁移、收缩能力的变化。结果 慢性哮喘组小鼠肺组织HDAC活性为(0.371±0.054) μmol/(L·μg),较正常对照组的(0.603±0.034) μmol/(L·μg)显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。TSA(0.5 μmol/L)作用后12～24 h,体外培养的大鼠气管平滑肌环及人支气管平滑肌细胞的α-sm-actin、SM22-α表达明显增加,作用后24 h及48 h支气管平滑肌细胞数目分别为(1.719±0.044)×104及(1.808±0.009)×104个,明显低于空白对照组的(1.911±0.048)×104及(2.537±0.01)×104个(P<0.05)。血小板源性生长因子(PDGF)诱导的支气管平滑肌细胞迁移数也在TSA作用后显著降低(88±7.632 vs 52±7.5,P<0.05)。此外,TSA作用24 h后的三维凝胶收缩率\[(9.885±7.084)%\]较空白对照组\[(44.844±3.808)%\]及PDGF组\[(41.315±7.943)%\]明显降低(P<0.05)。结论 慢性哮喘小鼠肺部HDAC的活性下降,可能与气道平滑肌细胞向“收缩型”转变有关,但HDAC活性下降并不增加细胞的收缩能力。     

川芎嗪联合葛根素对人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的 从细胞水平撂讨川芎嗪联合葛根素对促进内皮细胞的增殖和修复功能的影响.方法 采用体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行干预.检测HUVECs中MDA含量和SOD、t-PA、PAI-1活性.各组细胞上清液中漂浮细胞变化.结果 与模型组比较.川芎嗪联合葛根素用药能够显著降低HUVECs中MDA含量,差异具有统计学意义(p<0.05),提高内皮细胞SOD,t-PA活性,差异具有统计学意义(P<0.05)和降低PAl活性.差异具有统计学意义(P<0.05),减少缺氧后内皮细胞漂浮,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 川芎嗪联舍葛根素,改善细胞缺血缺氧显著优于川芎嗪及葛根素的单用,为临床用药提供科学的理论及实验依据.     

内皮祖细胞的体外移植和他汀类药物对大鼠急性肺损伤的保护作用及疗效比较

目的 探索细胞疗法暨内皮祖细胞(EPCs)移植法对急性肺损伤的治疗作用,比较体外移植内皮祖细胞、使用阿托伐他汀提高循环中内皮祖细胞数量和活性以及二者联合应用三种方法 的疗效.方法 取人脐带血分离内皮祖细胞,经一周培养;用脂多糖(LPS)造大鼠急性肺损伤(ALI)模型,分别口服给予阿托伐他汀、尾静脉注入BrdU标记的内皮祖细胞及两者联合给药.2日后评估其肺损伤的程度、肺血管诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达及免疫组化法追踪移植内皮祖细胞修复血管内皮的情况.结果 EPCs移植组和联合治疗组中,免疫组化可检测到肺血管内皮Brdu呈阳性的移植EPcs;大鼠肺动脉中iNOS表达较LPS模型组受到抑制;肺实质中,中性粒细胞(PMN)明显减少,肺水含量、透明膜形成及肺出血均减少.而他汀治疗组与LPS模型组未见明显差异结果 EPCs体外移植对ALI大鼠模型的肺血管内皮有保护作用,同时也维持了肺泡毛细血管屏障的完整性.而阿托伐他汀对移植EPCs有协同作用,联合应用将会取得更好的疗效.而单独的他汀药物治疗未见明显疗效.     

EXPRESSION OF TISSUE－TYPE PLASMINOGENACTIVATOR IN SMOOTH MUSCLE CELLS OF INJUREDILIAC ARTERIES IN RABBITS

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＩＳＳＵＥ－ＴＹＰＥＰＬＡＳＭＩＮＯＧＥＮＡＣＴＩＶＡＴＯＲＩＮＳＭＯＯＴＨＭＵＳＣＬＥＣＥＬＬＳＯＦＩＮＪＵＲＥＤＩＬＩＡＣ　ＡＲＴＥＲＩＥＳＩＮＲＡＢＢＩＴＳＭａＸｉａｏｌｉ；（马晓莉），ＨｕａｎｇＷｅｎｙｉｎｇ；（黄文...     

THE EFFECT OF RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE ON THE INHIBITORY ACTIVITY OF VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS TO THE PLASMINOGEN ACTIVATORS SECRETED BY ENDOTHELIAL CELLS

Cultured porcine endothelial cells (EC) produce and secrete plasminogenactivators (PA). If the serum free media incubated by vascular smooth muscle cells(SMC-CM) were mixed with the same media incubated by endothelial cells (EC-CM),the PA activities of the latter decreased significantly. Cocultivation of EC with SMC alsoresulted in a significant decrease (70.7%) of PA activities produced by EC. Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of SMC-CMfollowed by reverse fibrin autography demonstrated that the PA inhibitor had a molecularweight of 49000-62000. In this study we also investigated the effect of a Chinese herbalmedicine-Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM) on the inhibitory activity of SMC. The re-sults showed that RSM significantly decreased the inhibitory activity of SMC against thePA secreted by EC.     

兔血管内皮细胞与平滑肌细胞体外增殖的相互影响

目的　研究在体外培养条件下血管内皮细胞条件培养基（ECCM）、内皮素-1（ET-1）、内皮素转化酶抑制剂phosphoramidon对血管平滑肌细胞（SMC）增殖的影响,同时研究了血管平滑肌细胞条件培养基（SMCCM）对血管内皮细胞（EC）增殖方面的影响. 方法　EC和SMC均来源于兔主动脉,在获得了EC和SMC的条件培养基（CM）后,分别用两者以及ET-1进行实验,细胞的增殖率通过3H掺入法进行测定. 结果　ECCM和ET-1可明显促进SMC的增殖,并呈现剂量依赖性. 其最大效应分别为(190±11)% (100% ECCM)和(166±9)% (100 ng*L-1 ET-1). 而phosphoramidon存在条件下的ECCM使其分裂作用降低了(33±2)%. SMCCM抑制EC的增殖,这种抑制作用并非剂量依赖性,其最大的抑制效应为基本水平的(78±3)%. 结论　ECCM和ET-1可促进SMC的增殖作用. phosphoramidon可明显地抑制ECCM对SMC的增殖作用.同时SMCCM对EC的增殖起抑制作用.     

BALB/3T3小鼠纤维母细胞的条件液促进培养肥大细胞生长的初步研究

作者对正常和SV_(40)感染的小鼠胚纤维母细胞(BALB/3T3,SV3T3)的条件液(CM)能促进培养细胞的生长作用进行了研究。CM的生长活性用细胞增殖试验(MTT法)检测对来自小鼠骨髓培养的肥大细胞(CMC)的影响,发现来自纤维母细胞CM支持肥大细胞的增殖,且经病毒感染的CM可增进生长活性。     

丹皮酚对人胎儿平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：观察丹皮酚（Ｐａｅ）以人胎儿主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法：利用体外细胞培养技术,用人高脂血清造成平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖的模型并通过ＭＴＴ测定、细胞计数及透射电镜下的细胞超微结构的观察等方法,观察了Ｐａｓ对人胎儿平滑肌细胞的保护作用。结果：人高脂血清可明显刺激人胎儿平滑肌细胞的增殖并引起其表型的改变,而Ｐａｅ可呈浓度依赖性地抑制平滑机细胞的平殖并可显著抑制高脂血清对ＳＭＣ的促增殖作用。结论：Ｐａｅ抗动脉粥样硬化的作用可能部分是由于抑制ＳＭＣ异常增殖的结果。     

~(32)P胶体组织间注射抑制血管细胞增殖作用的研究

目的:观察32Pβ电离辐射对血管平滑肌和血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:不同放射浓度(0,0.37,3.7,37,74kBq/2ml)32P照射血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,用台芬蓝染色法,3H-TdR掺入法,流式细胞术和JMA法观察血管细胞活力、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。沿兔耳缘静脉将不同放射浓度(0,0.37,3.7,37,74kBq/2ml)的胶体32P均匀注入静脉周围,30d后取样观察血管细胞病理形态学改变,免疫组织化学技术检测增殖细胞核抗原和平滑肌肌动蛋白。结果:放射性浓度为0.37￣37kBq/2ml时血管细胞活力没有明显下降(P>0.05)。辐射对血管细胞增殖的抑制呈剂量依赖关系。受照射的血管细胞大部分停留在G0/G1期。放射性浓度>74kBq/2ml,细胞凋亡率明显上升,DNA裂解百分率显著升高(P<0.05),细胞结构呈凋亡样改变。病理形态学显示照射后组织血管数量减少。血管管腔闭塞。结论:32P胶体通过抑制海绵状血管瘤血管细胞增殖,促进血管细胞凋亡,最终导致血管闭塞来达到治愈海绵状血管瘤。     

特异性DNA倍增技术检测t-PA cDNA基因在表达细胞中的稳定性

利用特异性DNA倍增技术(polymerase chain Reaction,PCR)检测t-PA cDNA基因在表达细胞基因组中的稳定性,并对所得的PCR反应产物进行了限制性内切酶片段、分子杂交和核苷酸顺序分析等方面的研究,证实了t-PA cDNA基因已插入到表达细胞染色体中。这种方法快速、简便、灵敏度和特异性高,是检测基因工程表达细胞中cDNA基因稳定整合状况的好方法。     

猪心组织型纤溶酶原激活剂的提纯和鉴定

取猪心组织用丙酮去脂,pH4.2、0.45mol/L醋酸钾缓冲液抽提组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。抽提液经硫酸铵分段盐析,然后用纤维蛋白-Sepharose柱吸附t-PA,2mol/L硫氰酸钾洗脱的t-PA溶液经Sephadex G-150凝胶过滤,得到纯的t-PA。其比活性为39038.5 IU/mg,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其分子量为67000。提纯过程中应用了蛋白酶抑制剂(aprotinin)以及6-氨基己酸,以抑制单链t-PA转变为双链t-PA。t-PA活性测定以尿激酶(UK)为参考标准。     

以BA-ELISA法检测平滑肌细胞清道夫受体活性

本实验探讨用BA－ELISA方法检测培养的平滑肌细胞清道夫受体的方法。第10～15代平滑肌细胞接种于96孔板，加入氧化低密度脂蛋白培养一定时间，固定，按BA－ELISA法测定细胞结合及摄入氧化低密度脂蛋白的量，以反映清道夫受体的活性。结果表明，随培养时间延长至6～24h，清道夫受体活性已明显可测。说明第10～15代的平滑肌细胞在一定条件下可表达清道夫受体活性。     

急性白血病血浆组织纤溶酶原激活剂及其抑制剂活性的测定

应用发色底物比色分析法,对42例正常人和52例急性白血病(AL)病人血浆组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、组织纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)活性进行了检测.结果显示,初诊AL病人血浆t-PA活性较正常对照组显著升高(P<0.01),而PAI活性变化不显著;完全缓解期的AL病人,t-PA下降到正常范围;并发严重出血者,其t-PA活性和血小板计数与无出血者相比均有显著性差异(P<0.05);并发感染者,其PAI活性较非感染者及正常对照组均显著升高.提示血浆t-PA,PAI活性与AL病人不同的临床表现及其预后有关.