灵长类细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的进化分析

目的:利用玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段,对灵长类氧化酶亚基Ⅱ基因进行分子系统学分析。方法:实验于2003-03/2004-10在南方医科大学解剖教研室完成。①玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段。②通过Genbank数据库,采用“Blast”的方法进行相似性数据搜寻,选择合适的16种灵长类生物氧化酶亚基Ⅱ基因的686碱基序列片段;采用PAUP4.0DNA序列分析软件进行分析。结果:①利用玻璃粉吸附法成功扩增出了人的氧化酶亚基Ⅱ全基因片段,并对扩增片段进行了序列分析。②根据序列测定结果,结合生物信息学技术研究16种灵长类动物之间的分子进化关系,建立了新的分子进化树,其中一致性指数为0.5608,相似性指数为0.4392。结论:线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段可以作为进化分析的分子指标。     

在不同类型骨髓增生异常综合征Id4基因甲基化差异的初步研究

本研究探讨Id4基因在不同类型骨髓增生异常综合症（MDS）患者中的甲基化情况差异。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS—PCR）对50例不同类型MDS患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测,并以缺铁性贫血患者骨髓作为对照。结果发现：Id4基因在对照组骨髓中呈完全非甲基化状态,在MDS各种类型中,甲基化状态有差异：6例RA、2例RARS和4例MDS—U患者骨髓Id4基因均呈非甲基化状态,而18例RCMD中有2例。12例RAEBI和8例RAEBII中各有3例为Id4基因甲基化。骨髓原始细胞比例分别低于和高于5％的两组患者中,Id4甲基化分别有2例和6例,各占每组的6．7％和30％,差异有显著性意义。初步结论是：骨髓原始细胞比例高的MDS患者有可能发现Id4基因甲基化。     

脱落细胞线粒体基因A1555G突变在诊断线粒体耳聋中的应用

目的用PCR-RFLP技术检测脱落细胞(尿液沉渣细胞和颊黏膜细胞)线粒体基因A1555G突变,探讨脱落细胞用于诊断线粒体基因突变相关耳聋的可行性。方法收集福建省某特殊教育学校126名聋哑学生和1个线粒体基因A1555G突变的遗传性耳聋家系6例患者外周血及尿液沉渣细胞和颊黏膜细胞,用PCR-RFLP技术筛查患者是否携带线粒体DNA A1555G突变,并与测序法进行比较。结果尿液沉渣细胞检测线粒体DNA A1555G突变的检出率最高(9/132),颊黏膜细胞和外周血细胞均为7/132。PCR-RFLP筛查结果与直接测序法基本相符。结论脱落细胞适用于耳聋相关线粒体DNA A1555G突变检测。     

对近10年来再障的回顾

本文分析了北—大—院(1983—1992)年以来住院再障(AA)患者79例，其中急性11例，慢性(CAA)66例，纯红再障2例。再障转为MDS者6例，AA—PNEI综合症2例。AA转为MDS后又合并AIFIAI例。本文对59例CAA进行分析，并对13例典型CAA及其转为MDS者进行N—rag原癌基因点突变的检查。发现近几年来本院诊断MDS者明显高于AA，复查骨髓标本既往诊断为AA及后来转为MDS者的骨髓细胞皆有病态造血，骨髓增生程度较好多为2～3级，红系增生，M；E倒置，红系有成熟红细胞大小不等，嗜多染，H-J小体，核畸形，少数有核浆发育不平衡的大红细胞，髓系成熟停滞，胞浆中可见粗大兰色颗粒，巨核细胞5～6个。典型AA患者未发现有N—ras原癌基因点突变，既往诊断为AA以后转变成MDS患者有N—ras原癌基因点突变。本文对AA与MDS的鉴别进行了讨论，认为：骨髓病态造血，骨髓中可见到巨核细胞，有细胞遗传学改变者应高度怀疑为MDS。如能参考骨髓活检病理改变则AA与MDS的鉴别不难。本文认为AA与MDS可能有本质不同AA偏于良性疾患，MDS偏于恶性，由AA转为MDS可能因骨髓造血干细胞进一步受损AA也可能是MDS—RA型的急性非林巴细胞性白血病的早期阶段。     

恶性血液病FLT3基因突变的检测及临床意义

为了探讨FLT3基因及FLT3内部串联重复（ITD）突变与恶性血液病的关系及临床意义,采用PCR结合DNA测序技术分析32例急性髓系白血病（AML）、18例急性淋巴细胞白血病（ALL）、2例急性杂合性白血病（AHL）、12例骨髓增生异常综合征（MDS）、10例慢性粒细胞白血病（CML）、3例非何杰金淋巴瘤（NHL）及9例多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓单个核细胞中FLT3基因及FLT3/ITD突变,分析FLT3/ITD阳性患者的临床特征及疗效。结果表明：在32例AML患者中5例FLT3/ITD（15.6%）阳性,其中7例M3中1例、10例M4中1例、10例M5中3例;而在18例ALL、2例AHL、12例MDS和10例CML患者中未检测到FLT3/ITD突变;在3例非何杰金淋巴瘤（NHL）、9例多发性骨髓瘤（MM）患者中亦未检测到FLT3基因。对2例特征性突变进行了测序,其结果显示,ITD位于外显子14,长度为27-63bp,为单纯串联重复,FLT3/ITD序列包括有2个SH2-结合结构域（YEYV与YEYDLK）,其中1例出现氨基酸的替换,其ITD序列及氨基酸的替换均具有独特性,均未改变FLT3阅读框架。临床研究表明,FLT3/ITD阳性AML患者外周血白细胞数高（p〈0.01）,骨髓原始细胞比例高（p〈0.01）,化疗后有低缓解率趋势。结论：FLT3/ITD突变多见于M5患者,为框内突变。FLT3/ITD阳性的AML患者外周血白细胞数高,骨髓原始细胞比例高,伴低缓解率趋势。FLT3/ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。     

弱精症患者精子线粒体的相关研究分析

选取2013年5月~2015年3月本院收治的30例弱精症患者,采用对照的临床试验设计方法,应用反转录-聚合酶链反应监测线粒体细胞色素氧化酶亚基I和线粒体细胞色素氧化酶亚基II的表达水平,采用流式细胞术检测两组精子的凋亡率、线粒体膜电位和钙离子含量。与正常精子相比,线粒体细胞色素氧化酶亚基I和线粒体细胞色素氧化酶亚基II在弱精症患者中的表达明显降低(P0.05),凋亡率在弱精症患者中显著增加(P0.05),线粒体膜电位显著降低(P0.05)。钙离子含量在两组中无显著差异(P0.05)。人精子线粒体细胞色素氧化酶亚基I和线粒体细胞色素氧化酶亚基II表达降低,凋亡率增加和线粒体膜电位降低是精子活力下降的重要原因。     

急性白血病原代细胞TGF-βⅡ型受体同种型的发现及其临床意义

转化生长因子C（TGF-β）及其受体的基因突变已被证实在肿瘤形成中具有重要的作用，在许多肿瘤中都发现有TGF-βⅡ型受体（TβR-Ⅱ）表达异常或表达缺失。为了了解急性白血病患者TβR-Ⅱ基因是否存在异常，本研究应用大范围RT-PCR的方法分段扩增急性白血病原代细胞TβR-Ⅱ的编码序列，并结合序列测定技术，分别对6例急性白血病患者以及11例正常人TβR-Ⅱ的编码序列进行突变检测。全部患者经骨髓细胞形态检查符合FAβ诊断标准且骨髓原始细胞≥90％。肝素抗凝骨髓4－5ml，分离单个核细胞，用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录后行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段，克隆到PGEM-T载体，进行序列的测定。结果显示：在检测的病人中有2例病人中存在TβR-Ⅱ的同种型，而此2例病人临床预后不良。结论：部分白血病病人存在TβR-Ⅱ的同种型，而且该同种型可能与预后有关。     

精子活动力与线粒体酶活性的相关性

目前对生殖组织线粒体功能失调的研究很少,仍缺乏生物化学上的依据来证实线粒体功能和精子活动力的关系。线粒体能量代谢的最后通路是电子传递链,它是由线粒体内膜上的两个转运载体（辅酶Q和细胞色素C）和四个多聚酶复合物（复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）组成,其中,复合物Ⅰ为NADH脱氢酶,复合物Ⅱ为琥珀酸脱氢酶,复合物Ⅰ＋Ⅲ为NADH细胞色素C还原酶,复合物Ⅱ＋Ⅲ为琥珀酸色素C还原酶,复合物Ⅳ为细胞色素C氧化酶,柠檬酸合酶（CS）为线粒体的一个可靠的酶标记物。这些呼吸链酶活性的改变通常和各种线粒体功能失调有关。本文的目的是…     

骨髓增生异常综合征的诊断

目的提高骨髓增生异常综合征(MDS)诊断及分型的准确率。方法对2007年1月1日至2011年12月31日诊断为MDS的18例患者进行回顾性分析。结果 18例MDS患者分型中,难治性贫血(RA)4例(22.2%),难治性贫血伴环形铁粒幼细胞1例(5.6%),难治性血细胞减少伴多系发育异常5例(27.8%),难治性血细胞减少伴多系发育异常伴环形铁粒幼细胞2例(11.0%),难治性贫血伴原始细胞过多-Ⅰ5例(27.8%),难治性贫血伴原始细胞过多-Ⅱ1例(5.6%)。结论诊断MDS时,必须以细胞形态学诊断为主,将细胞形态学、骨髓病理学、细胞遗传学、临床资料和临床随访结合起来,可以在很大程度上提高MDS的诊断效率和准确性,避免漏诊、误诊。     

四君子汤修复脾虚大鼠线粒体细胞色素氧化酶的作用及机制

目的:运用灌服耗气破气中药联合饥饱失节复合因素建立脾虚大鼠模型,观察四君子汤对脾虚大鼠线粒体细胞色素含量及其氧化酶活性的影响。方法:实验于2004-04/2005-02在广州中医药大学第一附属医院内科实验室和广州中医药大学基础医学实验室完成。①选取清洁级1月龄SD大鼠40只,随机数字表法分成4组:正常组、脾虚模型组、自然复健组、四君子汤治疗组,10只/组。②除正常组以普通饲料进行常规喂养外,其余3组均建立脾虚模型。脾虚模型组隔日喂食,并以小承气汤(厚朴、枳实、大黄比例为3∶3∶2,制成100%水煎剂)灌胃,每次3mL/只,隔日1次,共30周。自然复健组前26周同脾虚模型组,后4周同正常组。四君子汤治疗组前26周同脾虚模型组,后4周以四君子汤(党参、白术、茯苓、甘草按1∶1∶1∶1制成100%水煎剂)灌胃,每次4mL/只。③检测各组大鼠骨骼肌、心肌、肝脏、胃黏膜4种不同组织线粒体细胞色素a,b,c,c1含量及细胞色素氧化酶水平,提取线粒体DNA,进行细胞色素氧化酶亚基COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ序列分析。结果:40只SD大鼠全部进入结果分析。①不同组织线粒体各种细胞色素含量检测结果:实验第30周,脾虚模型组骨骼肌、心肌、肝脏、胃黏膜部位的线粒体细胞色素a,b,c,c1均显著低于正常组(P<0.05);自然复健组均有所升高,接近正常组(P>0.05);四君子汤治疗组显著升高,超过正常组水平(P<0.05)。②不同组织线粒体细胞色素氧化酶含量检测结果:四君子汤治疗组骨骼肌、心肌、肝脏、胃黏膜部位的细胞色素氧化酶含量均高于脾虚模型组、自然复健组(P<0.01或0.05),与正常组基本相似(P>0.05)。③线粒体细胞色素氧化酶基因序列分析:脾虚模型组和自然复健组COXⅠa,COXⅡ,COXⅢ存在突变现象,正常组和四君子汤组未见COX亚基突变。结论:四君子汤能够修复脾虚所导致的mtDNA编码COX亚基损伤,提高细胞色素含量及其氧化酶的活性。     

Mitochondrial DNA sequence divergence in weevils of the Pissodes strobi species complex (Coleoptera: Curculionidae)

Mitochondrial DNA sequence divergence is unusually high between several species of the Pissodes strobi complex, in contrast to low allozyme and morphological divergences, and the ability to hybridize in the laboratory. We sequenced an 810 bp segment in seven individuals, representing four species in the P. strobi complex and one outgroup species, P. affinis Randall. The 810 bp segment covered the 3' half of the cytochrome oxidase subunit I (COI) gene. We also sequenced one specimen of P. strobi (Peck) over a 2301 bp region of mtDNA, extending from the 5' end of COI to the 3' end of COII. Uncorrected sequence divergences were below 1.1% among three specimens of P. schwarzi Hopkins, and between P. terminalis Hopping and P. nemorensis Germar. All other interspecific combinations in the P. strobi complex showed divergences of 6.0–7.5%. The outgroup species, P. affinis , had an average divergence of 12.8% from members of the P. strobi group. As in most other insects, A+T content in Pissodes mtDNA was high; transition:transversion ratio was high among lineages exhibiting low divergences, but declined with increasing sequence divergence; and inferred amino acid sequence divergences were low. The degree of sequence divergence differs markedly across different functional regions of the COI gene. The high mtDNA divergences within the P. strobi complex calculated from direct sequencing support earlier reports based on restriction site surveys; however, cladograms based on mtDNA sequence differ from those based on earlier work.     

Mitochondrial DNA sequence variation among populations and host races of Lambdina fiscellaria (Gn.) (Lepidoptera: Geometridae)

The hemlock looper, Lambdina fiscellaria (Gn.), is a recurring major forest pest that is widely distributed in North America. Three subspecies (L. f. fiscellaria, L. f. lugubrosa (Hulst) and L. f. somniaria (Hulst)) have been recognized based on larval host or adult pheromone differences, but no consistent morphological differences have been reported. To clarify their taxonomic status, we surveyed mitochondrial DNA (mtDNA) sequence and restriction site variation in two protein coding genes, cytochrome oxidase I and II (COI and COII), in populations across the range of L. fiscellaria. In addition to variation in COI and COII, we found an intergenic spacer region of 20–23 bp located between the tRNA tyrosine gene and the start of COI. Of the 141 speciments of L. fiscellaria assayed, 137 were grouped into two distinct mtDNA lineages, one of which was disproportionately associated with eastern populations and one with western populations. However, single specimens and two populations in eastern Canada had mtDNA resembling that of western populations. Three divergent and rare haplotypes had basal affinities to the two common lineages. The two major lineages of L. fiscellaria were diverged by approximately 2% from each other, as well as from the mtDNA of two outgroup species, L. athasaria (Walker) and L. pellucidaria (G. & R.). The two outgroup species had essentially the same mtDNA and may be conspecific. We interpret the pattern of mtDNA variation within L. fiscellaria as indicating genetic polymorphism within a single species without clear subspecific divisions, rather than evidence of multiple cryptic species.     

中国北方人群获得性骨髓衰竭综合征患者端粒酶基因突变的研究

目的 研究中国北方人群骨髓衰竭综合征(BMF)患者端粒酶复合体基因突变发生的频率.方法 收集北方地区4家综合医院诊断明确的BMF患者90例(包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症),正常对照45名.提取患者外周血DNA.PCR方法扩增TERC基因及TERT基因第一、二外显子,双脱氧核酸终止法测序.结果 90例BMF患者中发现2例TERC基因突变和2例TERT突变.TERC突变为n37 A→G和n 66G→C.TERT基因突变为n1870 G→T,造成氨基酸缺失E/*和n1780 G→T,造成氨基酸替换S/I.除TREC n37 A→G突变外,均为首次报道.其中1例TERT突变患者最终诊断为先天性角化不良(DKC),而非获得性BMF.90例患者最终确诊获得性BMF患者共89例,其中发现3例突变.中国北方BMF人群中端粒酶基因突变发生率为3.4%.结论 首次报道了我国BMF患者端粒酶基因的3种突变.中国北方人群中获得性BMF患者端粒酶复合体基因突变发生率为3.4%.端粒酶基因突变可引起端粒的缩短,可能是疾病发生的原因之一.     

MDS及MDS/AML患者基因突变与年龄相关性分析

目的:探讨骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)及MDS转化为急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者血液肿瘤相关的体细胞基因突变与患者年龄的相关性。方法:选取初诊MDS和MDS/AML患者共111例。采集患者骨髓样本或用初诊时留存的骨髓涂片,应用高通量基因测序方法检测血液肿瘤相关的58种基因的体细胞基因突变,分析基因突变与患者年龄的相关性。结果:111例患者中总基因突变阳性率为87.39%(97/111),共检测到28种基因的231例次突变。基因突变阳性组患者年龄显著大于突变阴性组(P<0.001)。突变阳性的患者中,老年组(≥60岁)突变率最高,为100%(14/14),成人(15-59岁)组突变率为89.04%(74/85),儿童(≤14岁)组突变率为75%(9/12)。儿童组人均突变基因数目为1.44个,成人组2.47个,老年组2.5个;成人组突变个数显著大于儿童组(P=0.02)。儿童组信号转导基因突变最常见,突变率为46.15%(6/13),老年组和成人组表观遗传调节基因突变最常见,突变率分别为34.29%(12/35)和22.40%(41/183)。转录因子基因突变率在老年人组突变率高于儿童组(50.00%vs 8.33%)(P=0.036);剪接因子基因突变率在成人组和老年组中均高于儿童组(44.71%vs 8.33%)(P=0.024)、(47.06%vs 8.33%)(P=0.036)。结论:不同年龄组MDS及MDS/AML基因突变有所不同,尤其儿童组与成人组及老年组差异显著,提示儿童MDS的发生可能具有与成人和老年人MDS显著不同的遗传因素。     

吸烟肺癌患者口腔黏膜细胞全线粒体DNA获得性突变分析吸烟/口腔黏膜获得性突变与康复预防

目的了解肺癌患者口腔黏膜mtDNA获得性突变情况,探讨肺癌外细胞的线粒体基因突变与肺癌的关系和作为对肺癌预测的生物学指标的可能性。方法利用时相温度梯度凝胶电泳法对12例肺癌患者(吸烟者10例,非吸烟者2例)口腔黏膜细胞及匹配的血液细胞线粒体DNA进行突变筛选,然后进行测序分析。结果在大部分吸烟患者中(8/9),发现口腔黏膜具有两个以上的获得性突变,而在两个非吸烟的患者仅发现1个突变。在11例(11/12,92%)患者中共发现有26个获得性突变,15个突变发生在高变的D环区(58%),11个在mRNA区(42%)。除303～309位点具有长度不稳定外,未见其他微卫星不稳定和5kb的大范围缺失突变。结论吸烟的肺癌患者口腔黏膜细胞线粒体DNA具有高发生频率的获得性突变。     

药物性耳聋相关线粒体12S rRNA突变

  目的  探讨极重度非综合征性耳聋患者线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)1555A > G和1494C > T突变情况。  方法  选取黑龙江省佳木斯地区聋哑学校学生和北京协和医院门诊散发的极重度感音神经性耳聋患者共208例作为研究对象, 使用基因芯片方法和限制性内切酶法对其mtDNA 1555和1494两个位点进行检测, 并用直接测序的方法进行验证。  结果  208例患者中共发现1555A > G突变者10例, 该突变的携带率为4.81%;未发现1494C > T突变。  结论  mtDNA 1555A > G突变在极重度非综合征性耳聋患者中阳性率较高, 而在汉族人群中1494C > T突变较为罕见。     

邯郸市特教学校耳聋患者线粒体12SrRNA基因突变分析

目的利用基因诊断的方法调查邯郸市聋哑学校非综合征型耳聋患者的常见分子病因,对线粒体12SrRNA基因编码区突变进行分析,以明确非综合征型耳聋患者发病的分子学基础,为耳聋基因的筛查和产前诊断提供实验和理论依据。方法用PCR法检查100名聋哑学生（年龄6岁-17岁,男性58例,女性42例）线粒体12SrRNA基因,直接测序法分别对线粒体12SrRNA基因的2个基因片段分析。结果①100例研究对象中,被测者聋前或其母亲孕期明确应用过氨基糖甙类抗生素者30例（30%）,30例中有4例（7.5%）存在线粒体基因A1555G位点突变。②PCR检测结果100例患者的DNA样本（线粒体12SrRNA基因的2个基因片段）进行PCR扩增,扩增产物片段大小与预期相符。③测序结果100名聋哑学校非综合征型耳聋患者中,携带线粒体12SrRNA基因A1555G点突变的10例（占10%）;携带线粒体12SrRNA基因C1494T点突变的2例（占2%）。结论河北省邯郸地区特教学校耳聋患者存在较高的线粒体12SrRNA基因A1555G突变发生率,线粒体12SrRNA基因A1555G突变发生率高于全国平均水平,通过其突变筛查可以有效避免高危人群出现耳聋。     

Phylogenetic relationships among muscoidea (Diptera: calyptratae) based on mitochondrial DNA sequences

The utility of a mitochondrial DNA (mtDNA) fragment of about 1100 bp (including partial COI and COII sequences and tRNALeu) for evolutionary studies in Muscoidea is discussed. The species investigated are Scathophaga stercoraria, Microprosopa pallidicauda and Trichopalpus fraterna (family Scathophagidae), Musca domestica (Muscidae), Lasiomma seminitidum (Anthomyiidae) and Fannia armata (Fanniidae). Comparisons were made with published mtDNA sequences of Drosophila, Anopheles and three Calliphoridae species. The molecular phylogeny obtained here matches the classical morphological taxonomy reasonably well. This varies considerably, however, at different taxonomical levels. At a high taxonomic level, there is a clear separation between the Nematocera and the Brachycera, but the Calyptratae-Acalyptratae division is not always supported. At a lower taxonomic level, all species belonging to the same family are well grouped, but at an intermediate level, within the Calyptratae, it is impossible to clearly separate the Muscoidea and Calliphoridae, preventing a firm conclusion on the phylogenetic relationships among Muscoidea families. The entire COI sequence of S. stercoraria, as well as other mtDNA sequences (including the proximal portions of the COI gene, tRNATrp, tRNACys and tRNATyr genes) in Muscoidea species, are also presented and discussed.