康莱特对Patu-8988细胞周期及其调节基因表达的影响

目的　研究康莱特注射液对人胰腺癌细胞周期及其调节基因表达的影响 ,探讨康莱特的药理机制。方法　通过流式细胞仪 DNA含量分析法检测康莱特对人胰腺癌细胞系 Patu- 8988细胞周期的影响 ,应用基因芯片技术分析加药前后细胞周期调节基因的表达差异 ,并以 Western blot对部分基因蛋白产物的表达进行验证。结果　 2 0 μl/ ml康莱特作用 Patu- 8988细胞 2 4 h后 ,G2 / M期细胞比率从(17.79± 0 .16 ) %上升至 (2 3.96 ± 2 .33) % ,而 S期细胞比率则由 (36 .6 1± 2 .97) %降至 (2 4 .76 ±4 .92 ) %。基因芯片结果显示 ,在 96条有关细胞周期的目的基因中共有 2 7条基因表达发生大于 3倍的显著变化 ,其中表达上调的基因 17条 ,下调的 10条。Western blot表明 cyclin A、cyclin B1、cyclin E、p2 1等蛋白表达改变与基因芯片结果一致。结论　康莱特的药理作用之一是使细胞周期相关基因的表达发生改变 ,从而影响细胞增殖。     

应用基因芯片研究康莱特对人胰腺癌Patu-8988细胞的凋亡诱导作用

目的 探讨康莱特注射液诱导人胰腺癌细胞(Patu-8988)凋亡过程中相关基因表达的变化。方法 通过流式细胞仪Annexin V／PI双染法研究康莱特诱导Patu-8988细胞凋亡的过程，应用基因芯片技术分析加药前后凋亡相关基因的表达差异，并以Western印迹对部分基因蛋白产物表达进行验证。结果康莱特对Patu-8988细胞的凋亡诱导作用呈时间依赖性。康莱特作用24h后，在96条有关凋亡的目的基因中共有17条基因表达发生大于3倍的显著变化，其中表达上调基因12条，下调基因5条。Western印迹表明P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白表达改变与基因芯片结果一致，同时Caspase-3底物多聚ADP核糖多聚酶被降解。结论 康莱特可使Patu-8988细胞中多个凋亡相关基因的表达发生改变，进一步揭示了其诱导胰腺癌细胞凋亡的作用机制。     

HDAC1基因沉默对人胰腺癌细胞PaTu8988细胞周期的影响

目的 探讨组蛋白脱乙酰基酶1( HDAC1)基因沉默对人胰腺癌PaTu8988细胞周期影响及可能机制.方法 常规培养胰腺癌PaTu8988细胞,分为对照组、阴性siRNA转染(c-siRNA)组及15、30 nmol/L HDAC1 siRNA转染组.采用脂质体2000转染细胞48 h后,应用蛋白质印迹法检测细胞HDAC1基因沉默效率及p21基因表达;流式细胞法检测细胞周期的变化.结果 与对照组比较,30 nmol/L HDAC1 siRNA组PaTu8988细胞的HDAC1蛋白表达明显下降,P21蛋白表达明显增加;G2/M 期细胞比例显著减少[(21.48±3.67)％比(28.28±2.94)％,P＜0.05],S期细胞比例显著增加[(50.20±6.85)％比(32.49±2.78)％,P＜0.05].结论 HDACl siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞HDACl的表达,引起细胞S期阻滞,其机制可能与上调p21蛋白表达有关.     

曲古菌素A对人胰腺癌PaTu-8988细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察曲古菌素A(tfichostatin A,TSA)对人胰腺癌PaTu-8988细胞增殖及细胞周期的影响.方法 不同浓度(0.1、0.5、2.0 μmol/L)TSA处理人胰腺癌PaTu-8988细胞,并设空白对照组.采用WST-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测细胞周期相关基因p21和cyclin DI mRNA的表达.结果 对照组、TSA 0.1μmol/L、0.5μmol/L和2.0μmol/L组的细胞存活率分别为(100.0±4.2)%、(88.5±4.2)%、(79.7±5.0)%和(64.3±7.2)%,各TSA组均显著低于对照组(P<0.01).TSA 0.1μmoL/L、0.5μmol/L组的细胞以G1期居多,2.0μmol/L组(50.29±7.53)%细胞阻滞在G2/M期.TSA各组p21 mRNA表达值分别为5.29±1.16、7.79±0.41、8.61±0.73,较对照组l,00±0.08显著升高(P<0.01);cyclin DI mRNA表达值分别为1.13±0.12、0.42±0.06、0.19±0.06,较对照组1.00±0.07表达降低(P<0.05).结论 TSA通过上调p21及下调cyclin D1基因的表达,导致细胞周期阻滞.     

吉西他滨对人胰腺癌Patu-8988细胞株APE/Ref-1的诱导作用

目的:研究人胰腺癌细胞株在吉西他滨化疗时APE/Ref-1基因表达的变化,并试图揭示其在胰腺癌化疗耐药中所起的作用.方法:不同浓度吉西他滨0、10、20、40及60μmol/L作用人胰腺癌Patu-8988细胞株24 h,分别以RT-PCR及Western blot方法测定作用后APE/Ref-1的mRNA及蛋白表达情况.结果:吉西他滨作用人胰腺癌Patu-8988细胞株24h后,APE/Ref-1的mRNA及蛋白表达水平明显上升,并与吉西他滨的浓度呈正相关(RT-PCR:r=0.645,P=0.012;Western blot:r= 0.598,P=0.020).结论:APE/Ref-1在胰腺癌化疗时表达明显增强,可能与化疗耐药性的产生有关,并提示针对APE/Ref-1的靶向干预可能有助于提高胰腺癌的化疗敏感性.     

抑制Survivin表达对胰腺癌细胞凋亡的影响

目的 探讨以Survivin为靶基因的胰腺癌基因治疗的可能性,为胰腺癌基因治疗提供依据.方法 采用化学合成的小十扰RNA(siRNA)和pGCSi载体中的小发夹RNA(shRNA)抑制胰腺癌细胞系PaTu8988的Sunrivin基因表达,通过观察胰腺癌细胞株Survivin基因表达的下调以及细胞形态、细胞凋亡、细胞活力、凋亡信号途径等的改变评价Survivin作为靶基因的治疗效果.结果 不同序列的siRNA和shRNA抑制胰腺癌细胞Survivin的表达后,Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);碘化吡啶(PI)染色法观察发现RNA干扰(RNAi)后细胞出现核皱缩、细胞凋亡率>20%;流式细胞仪检测发现RNAi后在G0/G1期前出现了亚二倍体峰(P<0.05);Western blot法检测发现RNAi后Casptrqe-3被激活(P<0.05).结论 通过抑制胰腺癌细胞PaTu8988的Survivin表达可以诱导肿瘤细胞启动凋亡程序,加速肿瘤细胞凋亡,由此可望提高胰腺癌的治疗效果.     

去甲斑蝥素对多发性骨髓瘤细胞周期和血管内皮细胞生长因子的影响

目的 探讨去甲斑蝥素(NCTD)抗骨髓瘤效应的机制.方法 利用流式细胞术检测不同浓度NCTD作用24h后细胞周期的改变,Western blot检测CDK1、cyclin A和cyclin B1的改变,免疫组化和RT-PCR测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达.结果 经NCTD处理24h后,随着NCTD浓度增加,G2/M期细胞明显增加,S期细胞明显减少,呈剂量依赖性;NCTD以剂量依赖的方式抑制cyclin B1、CDK1和cyclin A的表达;NCTD以剂量依赖的方式抑制VEGF mRNA和蛋白的表达.结论 NCTD对U266细胞有抗增殖和促凋亡作用,其作用机制可能与调节细胞周期和抑制VEGF的表达有关.     

乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响

目的 探讨HBV复制过程中HBx蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响. 方法 采用原代小鼠肝细胞为研究系统,用野生型HBV质粒(pHBV)和HBx蛋白表达缺失的HBV质粒(pHBV△X)分别转染细胞.Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、cyclin A及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16 (p16)、p21的表达水平；实时荧光定量PCR和Southern blot检测HBVDNA复制水平.两组之间比较用两样本均数t检验,多样本均数间的比较用方差分析及q检验. 结果 新分离肝细胞和原代培养24、48、72 h肝细胞的细胞周期蛋白表达水平无明显差异；转染48 h后,pHBV组细胞与pHBV△X组细胞周期蛋白条带灰度值相比,前者cyclin D1、p21、cyclin E表达量较高,p16的表达量较低,统计量t值分别为15.713,22.897,14.680,-19.584,P值均＜0.05.培养72 h后提取HBV DNA,Southem blot检测HBV DNA复制中间体松散环状DNA、双链线性DNA、单链DNA的水平,经条带灰度扫描,pHBV组的水平(分别为3288.336±448.011、6458.318±182.163、2760.613±393.561)明显高于pHBV△X组(分别为515.721±62.530、2122.228±28.347、1632.013±207.021)及空白对照组,P值均＜0.05；实时荧光定量PCR检测HBV DNA复制水平,pHBV组[每个细胞(987.50±47.80)拷贝]也明显高于pHBV△X组[每个细胞(303.67±33.94)拷贝],t=20.203,P＜0.05.结论 HBx蛋白能通过调节细胞周期中各蛋白的表达,使细胞由静止期(G0)进入DNA合成前期(G1)并停滞于G1期,从而促进HBV的复制.     

腺病毒介导的野生型PTEN抑制活化肝星状细胞系HSC-T6增殖的机制

目的 通过检测腺病毒介导的野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)对体外活化肝星状细胞(HSC)细胞周期的影响,探讨过表达的野生型PTEN抑制活化HSC增殖的可能机制. 方法 体外培养肝星状细胞系HSC-T6,以腺病毒为载体将野生型PTEN基因瞬时转染活化HSC,实验分为空白对照组、Ad-GFP组和Ad-PTEN组.流式细胞术测定HSC细胞周期时相,Western blot及实时定量PCR检测HSC的PTEN表达量,Western blot检测HSC的细胞周期素D1 (cyclin D1)和细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)表达水平.多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用Tukey检验. 结果 携带野生型PTEN基因的腺病毒(AD-PTEN)成功转染HSC,Ad-PTEN组G0/G1期HSC细胞数(67.68％±2.75％)较对照组(53.01％±2.37％)及Ad-GFP组(53.85％±3.0％)明显增高(F=38.59,P＜0.01);S期HSC细胞数(14.42％±1.81％)较对照组(22.17％±1.99％)及Ad-GFP组(21.54％±1.74％)明显降低(F=18.85,P＜ 0.01);G2/M期HSC细胞数(17.90％±2.70％)较对照组(24.82％±3.81％)及Ad-GFP组(24.62％±3.15％)明显降低(F=7.17,P＜0.01).腺病毒感染HSC后72h,Ad-PTEN组cyclin D1的相对表达量(1.12±0.07)较对照组(1.45±0.05)及Ad-GFP组(1.47±0.08)明显降低(F=42.86,P＜0.01),CDK4相对表达量(1.05±0.07)较对照组(1.41±0.03)及Ad-GFP组(1.43±0.06)也明显降低(F=67.01,P＜ 0.01).结论 过表达的野生型PTEN通过下凋cyclin D1和CDK4的表达,明显抑制体外活化HSC细胞周期的G1/S期转化,阻滞HSC细胞周期时相于G0/G1期,进而抑制其增殖.