一个遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系的基因诊断和生物信息学分析北大核心CSCD

遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症是由FⅦ基因突变引起的一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病,发病率约1∶500 000.临床表现多样,轻者无明显症状,重者可发生颅内或者内脏出血.实验室检查可见凝血酶原时间（PT）延长,部分活化凝血活酶时间（APTT）及凝血酶时间（TT）正常,FⅦ活性（FⅦ∶C）降低.目前FⅦ基因突变数据库包括了279种导致遗传性FⅦ缺乏症的突变.我们联合使用直接测序法及生物信息学方法对一个遗传性FⅦ缺乏症家系进行基因分析,并探讨其发病机制.     

3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型和基因型关系的研究

目的探讨遗传性抗凝血酶缺陷症家系表型和和基因型的关系。方法对3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系(家系1~3)作表型和基因型诊断:常规检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fg)、凝血酶时间(TT)以筛查凝血功能,发色底物法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性(PC∶A,PS∶A及AT∶A),免疫比浊法检测抗凝血酶抗原(AT∶Ag),Western blot检测血浆中抗凝血酶的分子量和含量;PCR扩增AT基因所有外显子及侧翼序列,DNA测序并进行基因分析。针对新基因突变,在100例正常人中检测相应突变以排除多态性,用TA克隆PCR产物测序鉴定杂合碱基缺失突变。结果 3名先证者均为反复发作的静脉血栓患者,凝血指标及PC∶A和PS∶A都正常,AT∶A分别为正常人(100%)的60%、52%和60%,AT∶Ag分别为16.9、14.1和11.4 mg/dl,Western blot显示3位先证者的血浆AT蛋白分子量正常(58 kD)而含量低于正常;基因分析发现3名先证者各携带1个杂合突变,分别为g.8263 C>T(Leu340Phe)、g.5894-6 del TTC(Phe122del)和g.5898 T>G(Phe123Cys)。3个家系中与先证者表型相似的成员,则携带有相同的AT基因突变;但除家系2先证者的父亲有静脉血栓外,家系1和3中含有相应AT基因突变的家庭成员均无血栓发生。结论 3名先证者遗传性抗凝血酶缺陷症分别由Leu340Phe、Phe122del和Phe123Cys突变所致,其中Leu340Phe和Phe123Cys突变为国际上首次报道。     

六例遗传性易栓症的血栓发生与实验表型及基因型关联分析

易栓症包括遗传性和获得性.获得性易栓症继发于手术创伤、制动、口服避孕药、母体免疫性疾病、恶性肿瘤等,遗传性易栓症主要是由蛋白C(PC)、蛋白S(PS)和抗凝血酶(AT)缺陷导致.AT缺陷的发病率为1/5000～1/500,病情较为严重.遗传性PC缺陷为常染色体显性遗传病,杂合子型PC缺陷症患者多在30～40岁发病,有很大一部分杂合子型不发病,纯合子和复合杂合较罕见.PS缺陷为常染色体显性遗传,杂合子型60％ ～ 80％患有深静脉血栓(VTE),发病年龄多在40～45岁[1].本研究对我院2010至2012年收治的6例AT、PC和PS缺陷的患者及其家系进行血栓发生及相关研究.     

一个纯合突变Tyr510Asp导致的遗传性凝血酶原缺陷症家系表型与基因分析

凝血酶原(凝血因子Ⅱ,FⅡ)是肝脏合成的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶,在凝血过程的第二阶段转变为凝血酶.遗传性凝血酶原缺陷症是由位于人类染色体11p11-q12的FⅡ基因突变引起的一种罕见常染色体隐性遗传性疾病,发病率约为1/200万,临床表现为程度不同的出血症状,其出血倾向的严重性与血浆FⅡ活性(FⅡ∶C)水平相关[1-2].研究表明该病是由于FⅡ基因中单核苷酸的插入、替代或缺失,导致FⅡ蛋白中氨基酸序列改变或产生终止密码子使翻译过程提前终止所致[3].我们对1个遗传性凝血酶原缺陷症家系成员进行表型检测及基因分析,报告如下.     

人血浆凝血因子V双抗体夹心ELISA测定

目的建立一种新的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),以测定人血浆凝血因子V(FV)抗原含量.方法采用兔抗人FV抗体为包被抗体,FV单抗为检测抗体,首次对中国正常人(n=26)和一个遗传性FV缺乏家系的有关成员血浆中的FV抗原进行了检测.结果所建方法线性范围广、特异性强、灵敏度高、重复性好,与FV活性测定有很好的相关性;正常人血浆FV抗原呈偏态分布;FV缺乏家系纯合子血浆FV抗原量只有正常人的2%,证实该家系为Ⅰ型遗传性FV缺乏症.结论该法是一种较好的FV蛋白定量测定法,可以对FV缺乏症进行辅助诊断和分型.     

三个遗传性抗凝血酶缺陷症家系临床表型和基因型分析

目的 探讨遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症先证者及其家系成员的AT活性(AT:A)、AT抗原含量(AT:Ag)及基因型在引起遗传性AT缺陷症发病的分子机制.方法 收集3例AT缺陷症先证者及其家系成员血浆标本,采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT:A和AT:Ag,提取外周血基因组DNA.用PCR法扩增AT基冈的全部7个外显子及侧翼序列,通过直接测序分析异常的突变基因.利用蛋白免疫印迹法分析血浆中AT含量的变化,用凝血酶生成试验检测患者体内的凝血状态.结果 3例先证者AT:A和AT:Ag均降低到正常值的50%左右,分别在AT基因外显子4区的第7386位核苷酸发生杂合性G＞C突变,导致W(Trp)225 C(Cys)错义突变;2号外显子区第2591位核苷酸发生C＞G突变,导致S(Ser)36 X(stop)无义突变;5号外显子区第9819佗核苷酸发生C＞T杂合突变,导致R(Arg)359 X(stop)无义突变.部分家系成员表型和基因型榆测结果与先证者一致.蛋白免疫印迹结果显示先证者及其家系成员血浆中的AT含量较正常混合血浆明显减少,凝血酶生成实验显示先证者体内呈现明显的高凝状态.结论 I型遗传性AT缺陷症中,W225C、S36X、R359X引起血浆中AT含量下降,是导致遗传性AT缺陷症的分子致病机制.     

两个遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系FⅪ基因突变分析

目的　检测两个中国汉族人遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系中FⅪ基因的突变。方法　检测先证者及家系成员血浆FⅪ∶C及FⅪ∶Ag ,并以其外周血单个核细胞中提取的基因组DNA为模板 ,PCR扩增FⅪ基因的所有外显子及其侧翼内含子序列 ,用DNA测序仪检测FⅪ的基因突变。结果　在两个家系中共发现三种基因突变 ,Trp2 2 8stop、Glu32 3Lys和Leu172Pro ,均为杂合型 ,且Leu172Pro为两个家系所共有。结论　三种FⅪ基因突变Trp2 2 8stop、Glu32 3Lys和Leu172Pro是导致中国人遗传性FⅪ缺陷的分子发病机制之一 ,突变Leu172Pro为国际首次发现。     

蛋白C基因G12918A突变所致Ⅰ型遗传性蛋白C缺陷症

目的研究一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系的遗传表型和基因特征。方法PC抗原（PC：Ag）和PS抗原（PS：Ag）检测采用酶联免疫吸附试验，AT抗原（AT：Ag）测定采用免疫比浊法测定；PC活性（PC：A）、PS活性（PS：A）和AT活性（AT：A）采用发色底物法在Sysmex1500全自动血凝仪上进行测定。用聚合酶链反应扩增3代家系10个成员PC基因各个外显子及侧翼序列，用直接测序法检测其基因突变点。结果该家系3代10名成员中，有8名PC抗原水平在1．06～1．92mg/L（参考值3．00～6．00mg/L）之间，PC活性在41％～67％（参考值70％～140％）之间，明显低于正常参考范围；而PS：Ag和PS：A、AT：Ag和AT：A均在正常参考值范围内。PC基因测序分析：8名成员存在Ⅸ号外显子第12918位核苷酸G→T突变，密码子TGG→TGA，使第372位Trp→Stop；并在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T的多态性。结论该家系为Ⅰ型遗传性PC缺陷症，PC基因Ⅸ号外显子存在第12918位核苷酸G→T突变，该突变是目前尚未报道的一个新的基因突变点；并在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T的多态性。     

I型遗传性抗凝血酶缺陷症两种新基因突变

目的 对两例遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断,并探讨其分子发病机制.方法 检测凝血与抗凝指标,并进行易栓症筛查和表型诊断.采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员AT抗原(AT:Ag)和AT活性(AT:A),抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因(GI号28906)7个外显子及其侧翼序列、5'及3'端非翻译区,利用直接测序法进行基因序列分析.针对先证者的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在正常人群中筛查以排除多态性.结果 先证者1和先证者2 AT:Ag分别为126 mg/L和117 mg/L,AT:A分别为49%和48%.先证者1和先证者2的AT基因2号外显子分别发现了杂合缺失突变3239～3240delCT和杂合无义突变3206A→T(K70Stop),其家系部分成员检测到相应的杂合突变.结论 两例先证者均为I型遗传性AT缺陷症,由AT基因3239-32ZlOdelCT和3206A→T(K70Stop)突变所致.     

一种新的抗凝血酶基因突变导致遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员AT活性（AT：A）、AT抗原含量（AT：Ag）进行检测及基因分析，探讨该遗传性AT缺陷症发病的分子机制。方法采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT：A和AT：Ag，提取外周血基因组DNA，PCR法扩增AT基因的全部7个外显子及侧翼序列，DNA序列分析AT的基因异常。结果先证者AT：A和AT：Ag分别为45％和97mg／L，为Ⅰ型AT缺陷症。AT基因外显子5区第9833位核苷酸发生杂合性T→A突变，引起Tyr363Stop（Y363X）无义突变。其他家系成员基因测序结果显示有4人（Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅲ7、Ⅲ14）存在该突变。结论该家系为I型遗传性AT缺陷症。AT基因外显子5区杂合性9833T—A无义突变引起AT缺陷，导致静脉血栓是该遗传性AT缺陷症的分子致病机制。该突变在国际上尚未见报道。     

凝血因子VII基因突变的检测

目的为检测福建省福州市一个遗传性凝血因子VII缺乏症先证者的因子VII基因突变类型。方法采有PCR结合限制性内切酶HgiCI，以先证者及其母亲的FVII基因片进行分析。结果表明先证者的FVII基因为C329G纯合子，其母亲为杂合子。结论该家系为FVII基因存在C329G突变的第2个遗传性因子VII缺乏症家系。     

五例遗传性凝血因子V缺陷症的基因分析

目的 分别对5例遗传性凝血因子V(FV)缺陷患者进行基因分析和家系调查,鉴定导致FV缺陷症的基因突变.方法 采用一期法检测血浆FV活性,ELISA法检测血浆FV的抗原含量,PCR法扩增FV基因的25个外显子及其侧翼序列,DNA测序并与基因文库比对以确定基因异常,限制性内切酶酶切分析或直接测序患者直系家属及正常人相应的等位基因排除多态性影响.结果 5例患者血浆FV活性和抗原含量均明显降低,基因分析共发现6个致病突变,分别为G69969T(G2079V)、C45533T(R712Ter)、C46796T(R1133Ter)、G45366A(C656Y)、C46253T(R952C)及G16088C(D68H),后3个是新的突变位点,其中C46253T(R952C)是国际上首次发现的位于B区的错义突变.通过对直系亲属和正常人相应的等位基因进行扩增测序或酶切分析证实了3个新的突变不是基因多态性所致.结论 鉴定了5例Ⅰ型遗传性FV缺陷症的基因突变,其中包括2种无义突变和4种错义突变;错义突变导致FV蛋白稳定性降低,引起血浆中FV的含量减少.     

Glu29→Gly纯合子突变导致的遗传性凝血酶原缺乏症

目的 对1个遗传性凝血酶原缺乏症家系进行凝血酶原(FⅡ)基因突变的检测。方法 用活化的部分凝血活酶时间（APTT)，凝血酶原时间(PT)及FⅡ促凝活性(FⅡ：C)、FⅡ抗原(FⅡ：Ag)测定进行表型诊断；用PCR法对先证的FⅡ基因14个外显子及其侧翼序列和5′端非翻译区(5′UTR)、3′端非翻译区(3′UTR)序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序，检测其基因突变。家系成员DNA在先证FⅡ基因突变区域扩增后测序。突变位点经限制性内切酶分析证实。103名健康献血作对照。结果 先证表型诊断为凝血酶原缺乏症(Ⅰ型)；FⅡ外显子区共发现3个与献报道的FⅡ基因序列不同的位点，其中位于第2外显子区的为纯合突变A601G。家系分析表明先证父亲、母亲和外祖母均为A601G杂合子。结论 纯合错义突变A601G引起的Glu29→Gly是导致该例遗传性凝血酶原缺乏的原因。     

极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患儿1例护理

正极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(very long-chainacyl-Co A dehydrogenase deficiency,VLCADD)主要是由于线粒体内脂肪酸β氧化中的关键酶(极长链酰基辅酶A脱氢酶)基因先天缺陷所致,是一种较罕见的常染色体隐性遗传性疾病[1]。VLCADD最早于1993年由Bertrand等[2]报道,目前诊断VLCADD的主要方法是基因分析,85%～93%的患儿可以被检测出基因突变[3]。     

抗凝血酶基因A9850G突变导致一个新的遗传性抗凝血酶缺陷症家系

目的对一个遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。方法用AT活性(AT:A)和抗原含量(AT:Ag)作实验诊断;用聚合酶链反应(PCR)对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变(H is369Arg),为国际首次报道。结果先证者表现为AT基因外显子5区的第9850位有A→G的杂合突变。结论该突变是遗传性AT缺陷症的一个新的突变位点,可以导致血栓形成。     

同源型凝血活酶试剂检测重组人野生型和突变型凝血因子Ⅶ

遗传性凝血因子Ⅶ（FVⅦ）缺乏症患者血浆中FⅦ凝血活性降低，出现不同程度的出血倾向。早先我们报道了遗传性FⅦ缺乏症2个家系患者的FⅦ基因存在Cys329Gly错义突变。为了研究该突变对FⅦ的功能影响，我们将野生型FⅦ和Cys329Gly突变型真核表达载体转染BHK-21细胞进行体外表达，并用自制同源型凝血酶原试剂[0]对表达产物进行凝血活性的检测。     

复合杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系分析

目的:对1个遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系进行临床表型及基因突变分析,探讨其分子致病机制.方法:检测先证者及其家系成员(共3代5人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原含量(FIB)、D-D二聚体(D-D)、凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ:C)和凝血因子Ⅻ抗原(FⅫ∶Ag)等凝血指标.采...     

人血浆凝血因子V双抗体夹心ELISA测定

目的 建立一种新的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA），以测定人血浆凝血因子V（FV）抗原含量。方法 采用兔抗人FV抗体为包被抗体，FV单抗为检测抗体，首次对中国正常人（n=26)和一个遗传性FV缺乏家系的有关成员血浆中的FV抗原进行了检测。结果 所建方法线性范围广、特异性强、灵敏度高、重复性好，与FV活性测定有很好的相关性；正常人血浆FV抗原呈偏态分布；FV缺乏家系纯合子血浆FV抗原量只有正常人的2％，证实该家系为I型遗传性FV缺乏症。结论 该法是一种较好的FV蛋白定量测定法，可以对FV缺乏症进行辅助诊断和分型。     

抗凝血酶基因杂合突变导致的抗凝血酶缺陷症

目的 对1例先天性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员进行AT表型及基因突变检测。方法 采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT活性（AT：A）和AT抗原含量（AT：Ag），并采用PCR法对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序检测基因突变。结果 先证者的AT：Ag正常，但AT：A为正常值的65％，表现为Ⅱ型AT缺陷，其AT基因外显子6区第13830位核苷酸发生了G—A杂合突变，引起Arg393His错义突变。同样突变也见于该家系其他3名成员。结论 该家系成员的Ⅱ型AT缺陷由AT基因G13830A杂合突变所致，可致血栓形成。     

SERPINC1基因缺陷导致的AT缺陷症患者易发生静脉血栓事件

目的分析12例抗凝血酶(AT)缺陷症患者的基因突变, 探讨SERPINC1基因突变与静脉血栓事件的关系。方法本文研究类型为观察性研究-描述性研究:病例系列。收集2014年4月至2021年4月温州医科大学附属第一医院12例AT缺陷患者临床资料, 在患者治疗前, 采集血标本。采用发色底物法检测血浆AT活性(AT:A), 免疫比浊法检测AT抗原(AT:Ag)含量。采用PCR直接测序法分析先证者SERPINC1基因7个外显子及其侧翼序列, 对发现的疑似突变用反向测序予以验证。分析SERPINC1基因突变与患者静脉血栓栓塞症(VTE)的相关性, 统计占比。结果 12例患者的AT:A在30%～66%, 均明显下降, 7例患者的AT:Ag 同步降低, 表现为Ⅰ型AT缺陷, 5例患者AT:Ag在参考范围, 表现为Ⅱ型AT缺陷。共发现12种SERPINC1基因突变, 其中6种杂合突变c.456₄58delCTT(p.phe121del)、c.318₃19insT(p.Asn75stop)、c.922G>T(p.Gly276Cys)、c.938T>C...