真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的 探索构建人血管生成素1(human angiopoietin 1，hAng-1)真核表达载体，转染体外培养兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stemcells，MSCs)修复骨缺损的可能性。方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hAng 1，经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs，G418筛选阳性克隆，RTPCR及免疫印迹杂交检测hAng-1 mRNA及蛋白表达。结果 重组真核表达载体pcDNA3-hAng-1经限制性内切酶Xho-I和BamH-I酶切后，电泳显示1．4kb hAng-1目的片段和5．4kb pcDNA3载体片段，转染兔MSCs后，RT-PCR检测出目的基因mRNA，免疫印迹杂交检出hAng-1的蛋白表达。结论 构建的真核表达载体pcDNA3-hAng-1能在转染的兔MSCs中表达，可以为组织工程骨修复奠定基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE）基因的真核表达载体，为修复阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法，从人的成神经细胞瘤的总cDNA中，扩增出1．5kb的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后，并由潮霉素进行筛选，可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3．1-BACE的真核表达载体，为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE，为治疗AD奠定一定的实验基础。     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

HSPb1真核表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中表达的研究

目的:构建重组人HSPb1真核表达载体质粒,为研究HSPb1与乳腺癌发生和化疗耐药的关系做准备。方法:从人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计引物调取目的基因片段,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH-5α,筛选菌落并抽提质粒。测序正确后双酶切克隆进入真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1-HSPb1。用pcDNA3.1-HSPb1转染人乳腺癌细胞MDA-MA-231,RT-PCR法和Western blot法鉴定重组质粒在其中的表达。结果:经酶切证实重组质粒pcDNA3.1-HSPb1含有目的基因HSPb1。RT-PCR和Western blot检测表明,mRNA和蛋白水平,转染细胞HSPb1的表达均明显增强。结论:pcDNA3.1-HSPb1真核表达载体构建成功,它在乳腺癌细胞中可高表达目的基因,为进一步研究HSPb1在乳腺癌发生及化疗耐药中的作用奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.     

RhoC基因真核表达载体的构建及其表达

目的 为探讨RhoC基因的功能以及其对肝癌的侵袭转移的影响提供实验模型。方法 用限制性内切酶酶切RhoC基因，定向克隆到pcDNA3.1上，利用脂质体将重组载体（pcDNA3.1-RhoC)空载体（pcDNA3.1)转染入HEPG2细胞，潮霉素选择培养，RT－PCR及免疫组化鉴定其稳定表达。结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1-RhoC在HEPG2细胞中有稳定表达。结论 本实验为深入研究RhoC基因的功能以及其对肝癌的侵袭转移的影响提供了理想的体外实验模型。     

重组型Caspase-3基因的构建及其在胰腺癌细胞中凋亡活性的观察

目的：通过对半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）大、小亚基的重组，构建pcDNA3.1( )/r-Caspase-3真核表达质粒，并探讨r-Caspase-3基因诱导细胞凋亡的可能性，以寻求肿瘤基因治疗的新途径。方法：采用分子生物学方法克隆Caspase-3的大、小亚基，并在体外进行重新排列组合，使大、小亚基原来的排序颠倒，构建出pcDNA3.1( )/r-Caspase-3真核表达质粒；脂质体瞬时转染人胰腺癌细胞PC-Ⅱ，RT-PCR检测r-Caspase-3 mRNA的表达；流式细胞技术（FCM）检测转染胰腺癌细胞凋亡状况。结果：Caspase-3的大、小亚基被完整克隆，pcDNA3.1( )/r-Caspase-3真核表达质粒测序结果证实小亚基位于大亚基之前；RT－PCR扩增出894bp大小片段，流式细胞检测可见明显的凋亡峰出现。结论：构建的r-Caspase-3其mRNA可在胰腺癌细胞中表达并自催化诱导细胞凋亡，可作为胰腺癌基因治疗的目的基因。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：VEGF—C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF—C的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有EcoRI和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT—RCR方法扩塔人乳腺癌细胞MDA—MB－231中的VEGF—C cDNA(1.26kb)；回收PCR产物(1．28kb)，并将其连接至克隆载体pUMT—18中，重组的pUMT—18在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF—C cDNA全长的酶切片断(1．27kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1（－)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT—PCR产物自有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pUMT—18中自有正确的人VEGF—C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1(-)中含有人VEGF—C cDNA全长序列。结论：VEGP—C/pcDNA3．1(－)。     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增，克隆构建真核表达质粒pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As。方法：从单纯疱疹 病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞上清液中提取HSV－2基因组DNA，以此为模板，用PCR方法扩增胸苷激酶（TK）基因，将扩增的片段克隆入载体pcDNA3中，挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切pcDNA3／HSV－Ⅱ TK，得到目的基因TK，将其克隆于已构建的真核表达载体pcDNA3/As上。结果：HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，基因序列与gendbank中报道相符。新质粒pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As经限制性核酸内切酶（BamH I,Hind Ⅲ）酶切后得到700bp(As）及1000bp（HSV－ⅡTK）相应基因片段。结论：本研究成功构建pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As真核表达质粒。     

大鼠ETFβ基因过表达对NADPH氧化酶基因表达的影响

目的:构建大鼠ETFβ的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达和对NADPH氧化酶的影响。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码ETFβ的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,测序正确后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR方法检测空载体组和重组质粒转染组的NADPH氧化酶各亚基mRNA水平的表达变化。结果:(1)测序结果证实PCR扩增得到编码ETFβ的cDNA序列正确;(2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,ETFβ融合蛋白成功表达;(3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的NADPH氧化酶5个亚基中的NOX3,NOX4的mRNA表达降低(P<0.05),空载体组和重组质粒转染组之间比较NOX1,NOX2,NOX5的mRNA表达差异无统计学意义。结论:成功构建大鼠ETFβ的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达,并且降低了NADPH氧化酶NOX3,NOX4的mRNA表达水平。     

人血栓调节蛋白基因编码片段的克隆及在真核细胞中的表达

目的 构建人血栓调节蛋白（hTM）基因真核表达质粒，并导人两种真核细胞[非洲绿猴肾母细胞（COS-7细胞）和脐静脉内皮细胞（HUVECs）]中表达，为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法采用PCR法扩增hTM基因的表达片段，HindⅢ＋EcoR Ⅰ酶切后与pcDNA3．1（＋）／neo质粒连接成pcDNA3．1／hTM。经鉴定确认后，由阳离子脂质体包裹转染COS-7细胞及HUVECs，RT-PCR和免疫组化法分别检测转染后细胞hTM的mRNA及蛋白的表达。结果双酶切及测序鉴定均证实hTM基因表达片段被成功克隆，pcDNA3．1／hTM经脂质体介导能有效地转染COS-7细胞和HUVECVs。结论成功构建pcDNA3．1／hTM重组质粒，并且能在两种真核细胞中高效表达，为进一步的基因治疗和对TM抗凝机理研究提供了物质基础。     

靶向PGRMC1基因sh RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定靶向PGRMC1基因的短发夹RNA (shRNA)真核表达载体。方法根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA (shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经MspI和smoi双酶切线性化的质粒载体中。为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染方法将构建好的3个重组载体导入人卵巢癌细胞株SKOV3中,采用免疫组化法和RT-PCR法检测SKOV3细胞系转染前、后PGRMC1基因表达。结果经限制性酶MsqI酶切位点的酶和Smo I双重消化,PGRMC1成功建立到pcDNA3.1(-)的真核表达载体中。通过RT-PCR和Western印迹分析证实重组质粒已经成功传递到SKOV3细胞系。结论靶向PGRMC1基因shRNA真核表达载体的构建成功,为进一步研究PGRMC1基因在SKOV3细胞中的作用奠定了实验基础。     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因在骨髓基质细胞中的共表达

目的 观察骨形成蛋白(BMP)-2、转化生长因子(TGF)-β1双基因真核表达载体在骨髓基质细胞中的共表达.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1为模板,分别用引入新的酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增出1188 bp长度的BMP-2和1173 bp长度的TGF-β1两个目的 基因片段;依次将其定向克隆入真核双基因表达载体pIRES;酶切、分析及序列测定重组子:然后,用脂质体包裹转染骨髓基质细胞;荧光定量逆转录(RT)-PCR方法 检测BMP-2及TGF-β1基因的共表达情况.结果 双酶切可见1188 bp的BMP-2条带及核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-131构建正确,并在骨髓基质细胞中能同时高效表达BMP-2和TGF-β1 mRNA.结论 BMP-2和TGF-β1双基因真核载体能够在骨髓基质细胞中实现BMP-2和TGF-β1基因共表达.     

bFGF基因修饰雪旺细胞表达的实验研究

目的 利用基因工程技术将外源bFGF基因以质粒pcDNA3.1为载体导入大鼠雪旺细胞,观察外源bFGF基因在雪旺细胞中的表达水平.方法 通过预变性大鼠坐骨神经、混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;将真核表达质粒pcDNA3.1及外源bFGF基因片段双酶切,酶切片段回收后重组bFGF-pcDNA3.1质粒;通过脂质体转染法将pcDNA3.1-bFGF质粒导入雪旺细胞,用EIASA及RT-PCR方法分别从蛋白质水平及mRNA水平检测bFGF的表达情况.结果 经外源bFGF基因修饰的大鼠雪旺细胞,bFGF的表达水平极大提高(H=126.835,v=2,P=0.000),并且相对持续、稳定.结论 bFGF基因修饰的雪旺细胞能持续稳定高水平地表达分泌bFGF,将bFGF基因与雪旺细胞移植载体相结合治疗脊髓损伤具有独特的优势,为下一步bFGF基因修饰细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究奠定了基础.     

重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的构建

目的 构建具有绿色荧光蛋白报道(GFP)基因的端粒酶真核质粒载体，为转染细胞、延长细胞寿命提供基础。方法 酶切含人端粒酶逆转录酶(hTRT)基因的pGRNl45质粒获取hTRT片段，插入经酶切及磷酸化处理的GFP载体pEGFP—C1，形成8．1kb质粒，经HindⅢ、NotI酶切电泳筛选、鉴定并测序。结果 经酶切电泳分析得到3．4kb及4．7kb大小的两片段；测序结果显示接头两端序列正确。结论 重组竭粒酶pEGFP—hTRT质粒的成功构建，可用于细胞转染，对进一步研究组织工程种子细胞的衰老问题具有重要意义。     

中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的 观察中国人肠道产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酰辅酶A脱羧酶基因(oxc)的分离、克隆及其在293细胞中的表达.方法 提取中国人肠道Ox.F的基因组DNA,PCR扩增oxc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP-C1,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定基因片段.将重组质粒脂质体转染至293细胞,利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测oxc基因在真核细胞中的表达.结果 中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因全长1707 bp,与Gene Bank中的序列比较,碱基序列的同源性为93.61%,氨基酸残基序列的同源性为97.18%.重组质粒转染293细胞后24～48 h,可观察到明亮的绿色荧光,从mRNA和蛋白水平上可以检测到oxc基因在真核细胞中的表达.结论 中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出oxc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因存在一定的变异;oxc基因可在真核细胞293细胞中表达.