血管紧张素Ⅱ对人内皮细胞转录因子NF－kB的激活机制及其对血小板源生长因子B链基因转录的影响

目的：研究血管紧张素Ⅱ对ECV304细胞中转录因子NF－kB的作用和对血小板源生长因子B链（PDGF－B）基因表达的影响。方法：采用电泳迁移率移动分析（EMSA）,免疫组织化学方法,共聚焦显微镜及金颗粒标记免疫电镜技术;荧光素酶报告基因与变异型激酶质粒共转染的方法及Northern印迹法研究血管紧张素Ⅱ激活ECV304细胞NK－kB的信号传递路径和检测了血管紧张素Ⅱ刺激前后ECV304细胞PGF－BmRNA的表达水平。结果：血管紧张素Ⅱ刺激后,在ECV304细胞内有NK－kB的激活及核易位过程,应用免疫荧光聚集显微镜,免疫镜及Northern印迹等方法均可观察到PDGF－B或其基因表达增高。变异型激酶质粒IKKa-KM,IKKβ－KM及NIK－Km可抑制经血管紧张素Ⅱ刺激的转染细胞内与NF－kB启动相连的荧光素酶的表达。结论：血管紧张素Ⅱ可激活胞质内NK－kB并出现核易位,激酶NIK、IKKα和IKKβ参与了此信号传递路径,血管紧张素Ⅱ刺激后PDGF－B链mRNA水平增高。     

rhGH对Jurkat细胞中NF-κB活性的影响

目的:探讨重组人生长激素(rhGH)对Jurkat细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路活化的影响.方法:(1)将含荧光素酶报告基因的质粒pNF-κB-luc转染入T淋巴细胞系-Jurkat E6-1细胞中,在培养液中加入梯度浓度rhGH.(2)用梯度浓度rhGH直接刺激Jurkat细胞,然后用RT-PCR方法检测IκBα、IKK1 mRNA表达情况.结果:各浓度rhGH对转染pNF-κB-luc的Jurkat细胞中荧光素酶表达有促进作用,而对IκBα、IKK1 mRNA表达无显著影响.结论:rhGH对PHA活化的T细胞NF-κB的活化有促进作用,而对与NF-κB活化相关的IκBα和IKK1的mRNA表达无显著影响.     

血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞表达TSLP及信号通路研究

目的:观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是否可以刺激血管平滑肌细胞(VSMC)表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP),探讨核因子-κB(NF-κB)信号途径在这一过程中的作用.方法:原代培养VSMC,分别用Ang Ⅱ及Ang Ⅱ联合 NF-κB 特异性抑制剂PDTC干预.采用免疫组织化学染色检测胞浆中TSLP的表达,用ELISA法检测细胞培养上清液中TSLP的浓度,用电泳迁移率实验(EMSA)检测 NF-κB的结合活性.结果:正常未经处理的VSMC几乎不表达TSLP,经Ang Ⅱ刺激后胞浆及上清中的TSLP明显增加,并有浓度和时间依赖性,经PDTC预处理后TSLP表达量明显减少.相同条件下Ang Ⅱ可激活VSMC的NF-κB信号通路,PDTC可抑制这一过程.结论:Ang Ⅱ能够刺激血管平滑肌细胞表达TSLP,其作用机制可能是上调了NF-κB的结合活性.     

IKKα、β、ε及TBK1在CD154诱导转录因子NF-κB活化中的作用

目的 研究IκB上游激酶IKK在CD40配体CD154诱导NF-κB活化中的作用机制以及与构架蛋白TRAF的相关性。方法 应用重组CD154刺激EBV／LMP1阴性Ramos B细胞，研究IKK质粒转染表达对NF-κB Iuciferase活化的影响，并通过IKK免疫复合物激酶试验测定IKK对GST-IκB-α磷酸化活性以及免疫共沉淀试验判断IKK与TRAF的相互关系。结果 IKKα/β、IKKε和TBK1活性在CD154刺激5～15min内达到高峰；抗IKKα磁珠可以免疫共沉淀IKKβ，反之亦然。而抗IKKε或TBK1磁珠不能共沉淀其他3种IKK；CD154刺激诱导TRAF2与IKKε和TBK1，TRAF5与TBK1共沉淀增加，而TANK与TBK1共沉淀减少。IKKα或IKK43并不与TANK或任何TRAF共沉淀。结论 CD154刺激诱导IKKα、β、ε及TBK1活化，并诱导TRAF2与IKKε和TBK1结合，TRAF5与TBK1结合，而TANK与TBK1逐渐解离。IKKα/β激酶复合物位于IKKE和TBK1的下游。     

Rel／NF—κB／IκB／IKK信号转导途径与动脉粥样硬化

Rel/NF-κB/IκB/IKK信号转导途径与动脉粥样硬化的发生发展具有密切的相关性,AngⅡ可激活NF-κB,诱发内皮细胞炎症反应.Rel/NF-κB/IκB/IKK途径可能为动脉粥样硬化发病的始动机制.     

抑制核因子-κB活性对TNF-α诱导的肾小球系膜细胞血管紧张素原表达的影响

目的： 研究抑制核因子-κB（NF-κB）活性对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的SD大鼠肾小球系膜细胞血管紧张素原表达及血管紧张素Ⅱ产生的影响。方法：分离SD大鼠肾小球系膜细胞分为下列3组：对照组,TNF-α处理组,TNF-α＋NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）处理组（TNF-α＋PDTC处理组）。以电泳迁移率变动分析法（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测NF-κB 活性,放射免疫分析法检测培养液血管紧张素Ⅱ水平,RT-PCR方法检测血管紧张素原mRNA表达,蛋白质印迹法（Western blotting）检测血管紧张素原蛋白表达。结果： TNF-α处理组NF-κB活性［（20.67±9.14）×102 μg/cell］显著高于对照组［（8.25±4.35）×102 μg/cell,P<0.01］与TNF-α＋PDTC处理组［（7.20±4.57）×102 μg/cell,P<0.01］,TNF-α＋PDTC处理组与对照组比较无显著差异。血管紧张素原mRNA表达TNF-α处理组（0.27±0.05）显著高于对照组（0.20±0.05,P<0.05）,与TNF-α＋PDTC处理组（0.22±0.06,P>0.05）比较无显著差异;蛋白表达TNF-α处理组［（0.60±0.19） μg/cell］显著高于对照组［（0.37±0.15） μg/cell,P<0.05］及TNF-α＋PDTC处理组［（0.37±0.17） μg/cell,P<0.05］,TNF-α＋PDTC处理组与对照组比较无显著差异（P＞0.05）。培养液血管紧张素Ⅱ水平在TNF-α处理组［（9.73±2.38）×10-5 ng·L-1/cell］显著高于对照组［（7.50±1.51）×10-5ng·L-1/cell,P<0.05］及TNF-α＋PDTC处理组［（6.94±1.46）×10-5 ng·L-1/cell,P<0.05］,TNF-α＋PDTC处理组与对照组比较无显著差异（P＞0.05）。结论：TNF-α可激活SD大鼠肾小球系膜细胞NF-κB,并诱导血管紧张素原表达及血管紧张素Ⅱ产生增加;抑制NF-κB活性可降低血管紧张素原表达及血管紧张素Ⅱ产生。结果提示NF-κB介导TNF-α诱导的肾小球系膜细胞血管紧张素原表达及血管紧张素Ⅱ产生。     

NF-κB介导大鼠肾小球系膜细胞Visfatin对肾素血管紧张素系统mRNA表达的影响

目的观察大鼠肾小球系膜细胞中内脏脂肪素（Visfatin）对肾素血管紧张素系统（RAS）mRNA表达的影响及探讨其机制。方法分别构建Visfatin表达载体质粒及Visfatin RNAi表达载体质粒,将细胞分为8组：正常糖对照组、正常糖＋NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫基甲酸酯（PDTC）组、过表达Visfatin组、过表达Visfatin＋PDTC组、空白过表达载体组、空白过表达载体＋PDTC组、Visfatin RNAi组及空白沉默载体组,用Realtime-PCR方法检测血管紧张素原（AGT）、血管紧张素转化酶（ACE）、血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）、血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2R）等RAS相关基因表达,使用电泳迁移率变动分析法（EMSA）检测NF-κB活性,比较各组间基因表达及NF-κB活性的差异;以及通过观察PDTC处理对照组、过表达Visfatin组、空白过表达载体组前后上述指标的变化。结果细胞过表达Visfatin后,NF-κB活性、Visfatin、AGT、AT1R mRNA表达量显著升高,分别为正常糖对照组的1.52、11.42、2.85、1.25倍（P均〈0.01）;转染RNAi质粒pSIREN-Visfatin/sh RNA后,NF-κB活性、Visfatin、AGT、AT1R mRNA表达量显著降低,分别为正常糖对照组的10.90%、26.83%、30.00%、73.47%（P均〈0.01）。经PDTC处理的各组NF-κB活性、AGT mRNA表达量与相应的未经PDTC处理组相比显著降低（P〈0.01）,正常糖＋PDTC干预组NF-κB活性、AGT mRNA表达量是正常糖对照组的21.60%、34.59%;过表达Visfatin＋PDTC干预组的NF-κB活性、AGT mRNA表达量是过表达Visfatin组的37.96%、19.72%;空白过表达载体＋PDTC干预组NF-κB活性、AGT mRNA表达量是空白表达载体组的52.53%、33.08%,差异均具有统计学意义（P〈0.01）。结论在大鼠肾小球系膜细胞中,Visfatin可通过NF-κB引起RAS相关基因表达的变化。     

JNK3抑制NF-κB转录活性的研究

目的研究人c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N-terminal kinases3,JNK3)对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)转录活性的影响。方法构建人JNK3真核表达载体pcDNA3.1-JNK3,与3×κB-luc报告基因质粒共转染人胚胎肾细胞293(HEK293),分别进行如下处理:共转染50ngpCMV-Myc-p65质粒;转染24h后,加入浓度为10ng/ml的TNF-α或IL-1β刺激6h,收集细胞,检测荧光素酶活性。结果成功构建了pcDNA3.1-JNK3真核表达载体;提高细胞内p65水平,加入TNF-α或IL-1β刺激均可明显激活NF-κB的转录,JNK3对NF-κB的转录活性有明显抑制作用,且随着JNK3转染剂量的增加,抑制作用增强。结论JNK3能明显抑制NF-κB的转录活性。     

C反应蛋白促进离体SHR大鼠血管平滑肌细胞的增殖

目的： 探讨C反应蛋白（CRP）对SHR大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法： SHR大鼠VSMC培养，取3-4代细胞进行药物干预。先加入CRP和CRP受体CD32的抗体，测定NF-κB和抑制蛋白I-κB在VSMC中的表达；再使用NF-κB活化抑制剂PDTC，观察对血管紧张素Ⅱ诱发VSMC增殖的影响。结果： 使用CRP后，SHR大鼠VSMC的NF-κB和抑制蛋白I-κB的表达增强；使用CD32抗体可以抑制这种增强； PDTC可以抑制血管紧张素Ⅱ促进平滑肌细胞的增殖作用。结论： CRP可以通过直接激活SHR大鼠VSMC的 NF-κB，促进其VSMC增殖。     

HSP72过度表达对脂多糖刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响

目的研究过度表达的热休克蛋白72(heat shock protein,HSP72)对脂多糖(lipopolysaccha-ride,LPS)刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响.方法构建pCD-hsp72重组质粒,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选稳定转染hsp72基因的细胞,Western印迹检测转染细胞HSP72的表达水平及LPS刺激后RAW264.7细胞内HSP72的表达水平、LPS刺激后转染细胞中IκBα的含量和胞核中NF-κB的含量的变化.结果构建pCD-hsp72重组质粒并转入巨噬细胞,获得稳定转染hsp72基因的细胞株,LPS刺激细胞内HSP72表达增加;HSP72可通过减少LPS刺激的巨噬细胞中IκBα的降解而抑制NF-κB活性.结论HSP72能抑制LPS激活的巨噬细胞中NF-κB的活化.     

幽门螺杆菌过氧化氢酶对SW480细胞中NF-κB和ERK通路的影响

目的观察重组幽门螺杆菌（Helicobacter priori，Hp）过氧化氢酶（catalase，CAT）对SW480细胞内核转录因子（nuclear factor，NF）κB和细胞外信号调节激酶（extrocellular-signal regulated protein kinase，ERK）通路的影响。方法用脂多糖（LPS）刺激SW480细胞，再用CAT预孵育和处理；采用免疫组织化学方法检测细胞内NF-κB的表达水平，应用Western blot方法检测细胞质内κB的蛋白表达量，电泳迁移率改变分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）观察NF-κB的激活；应用激光共聚焦显微镜和Western blot方法观察ERK的核内外易位及磷酸化。结果重组坳CAT与商品化CAT的作用相同，预孵后，NF-κB的表达和激活较LPS组和处理组明显减少，ERK核内易位和磷酸化亦明显减少，但较正常对照组仍明显增加。结论坳CAT能够抑制NF-κB和ERK通路。     

Survivin shRNA对食管癌细胞c-myc、核因子-κB基因表达的影响

目的探讨Survivin对c-myc、核因子(NF)-κB基因的调控作用。方法 shRNA干扰沉默食管癌ECA109细胞系中Survivin基因表达,观察c-myc、NF-κB基因的表达变化,流式细胞术检测细胞周期的改变。结果1.食管癌ECA109细胞系中,Survivin shRNA干扰下调Survivin表达后,c-myc mRNA及蛋白的表达水平明显降低;2.Survivin表达后,NF-κB mRNA及NF-κB总蛋白无明显变化,但其蛋白活化表达水平明显降低,NF-κB上游调控核因子κB抑制物激酶(IKK)α、IKKβmRNA表达下调; 3.Survivin表达下调导致G2期延长,G2期细胞比例增加,细胞增殖阻滞。结论 Survivin在转录及蛋白水平对c-myc具有正向调控作用,Survivin表达下调抑制了IKKα、IKKβmRNA的表达及NF-κB的磷酸化。     

β-细辛醚抑制核转录因子Kappa B表达

目的β-细辛醚对核转录因子κB(nuclear factor Kappa B,NF-κB)表达的影响,为进一步应用开发打下基础。方法培养RAW264.7细胞,脂质体LipofectamineTM2000转染NF-κB启动子双荧光素酶报告基因分析系统Luc2P/NF-κB-RE/Hygro,0.2μg/mL LPS刺激,以15、150μmolβ-细辛醚干预,孵育24 h后检测相对荧光素酶活性;按以上分组干预培养RAW264.7细胞,采用蛋白免疫印迹法检测NF-κB蛋白表达。结果荧光素酶报告基因结果表明,β-细辛醚有抑制NF-κB启动子活性作用,且随剂量增大抑制作用增强;蛋白免疫印迹法结果表明,β-细辛醚有抑制NF-κB蛋白表达作用,且随剂量增大抑制作用增强。结论β-细辛醚能抑制NF-κB转录与表达,可能有较强的抗炎作用。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路促进细胞炎症因子释放

目的：探究SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a介导NF-κB激活,进而诱导炎症因子产生的分子机制。方法：双荧光素酶报告基因试验检测ORF7a对NF-κB激活的影响,qRT-PCR检测ORF7a对细胞中炎症因子表达的影响,Western blot、核质分离及免疫荧光技术检测ORF7a蛋白对p65磷酸化及入核的影响,免疫共沉淀及免疫荧光技术检测ORF7a的作用靶标蛋白。结果：报告基因试验表明ORF7a显著激活NF-κB启动子活性,并呈剂量依赖性（P<0.001）,而对AP-1报告基因的激活无明显影响。ORF7a显著上调细胞因子TNF-α、IL-β及IL-8 mRNA表达（P<0.05）。Western blot结果显示ORF7a显著增强p65蛋白磷酸化（P<0.05）及p65的入核（P<0.01）。免疫共沉淀实验发现ORF7a与NF-κB信号通路分子IKKβ蛋白存在相互作用,免疫荧光实验也证实ORF7a与IKKβ具有共定位。结论：SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路,进而促进细胞中炎症因子的释放。     

CD40-P227A单核苷酸多态性与B细胞信号系统活化的研究

目的 探讨CD40的单核苷酸多态性突变(CD40-P227A SNP)对B细胞核因子κB(NF-κB)和活化蛋白1(AP-1)信号系统和B细胞功能的影响.方法 使用人Ramos B淋巴瘤细胞株,分别将融合黄色荧光蛋白(CFP)的野生型CD40和突变型CIMO-P227A质粒,连同表达荧光素酶的NF-κB或AP-1质粒,或融合绿色荧光蛋白(GFP)的NF-κB质粒共转染至Ramos细胞中.用荧光素测定法和流式细胞仪分析检测NF-κB和AP-1信号系统的活化水平.用免疫印迹和ELISA等方法检测IκBα的降解和NF-κB亚单位的核内转移情况.结果 与野生型CD40比较,CD40-P227A可诱导增加NF-κB和AP-1的信号活化,并促进IκBα的降解和NF-κB亚单位的核内转移.转染CD40-P227A质粒的细胞分泌IL-6和TNF-α较转染野生型CD40质粒的细胞明显增多.结论 CD40-P227A SNP是一种功能性突变,可诱导NF-κB和AP-1信号系统活化,可能为系统性红斑狼疮的易感因素.     

NF-κB对内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡的影响

目的观察NF-κB激活和抑制对血管内皮细胞凋亡的影响。方法获取和培养原代脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,分别以NF-κB-decoy和错配-decoy预处理细胞,然后以内毒素LPS刺激诱发内皮细胞凋亡,设立单一LPS处理组和空白组做对照,比较各组之间NF—κB活性和凋亡率差异。结果LPS显著增加血管内皮细胞凋亡,NF-κBdecoy组NF—κB活性被显著抑制（P〈0．05）,而错配decoy组则不受影响;LPS组,错配decoy组和NF-κBdecoy组凋亡率依次递减,三组之间P〈0．05。结论NF-κB激活可促进血管内皮细胞凋亡,抑制其活性可能减轻由于内皮细胞凋亡带来的毛细血管渗漏。     

NF-κB/REL激活的信号机制

NF-κB/REL蛋白是进化学上高度保守的一种免疫反应介质。多种不同的刺激信号都可激活核转录因子参与细胞的生长、分化、发育、凋亡、粘附及炎症反应。激活NF-κB的信号机制十分复杂。不同的刺激信号,不同的细胞种类,以及细胞不同的状态所涉及的NF-κB激活的具体信号通路有可能不同。随着一些IκB家族成员激酶的鉴定及其相关敲剔基因模型的建立,人们对NFκB激活的信号机制有了更深入、全面的认识。     

显性失活IκBα质粒对胰腺癌PC-3细胞株核因子-κB和环氧合酶-2表达的影响

目的：观察显性失活IκBα质粒转染胰腺癌PC-3细胞株后，对细胞核因子-κB（NF-κB）和环氧合酶-2（COX-2）表达的影响。 方法： 免疫组织化学证实NF-κB和COX-2在胰腺癌PC-3细胞株中的表达，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）检测PC-3细胞转染显性失活IκBα质粒后，细胞中NF-κB和COX-2表达的变化。 结果： 胰腺癌PC-3细胞株中存在NF-κB和COX-2的表达，转染显性失活IκBα质粒后，细胞中NF-κB和COX-2表达均下调，且体现出一定的时间依赖性关系。 结论： 胰腺癌PC-3细胞株中存在NF-κB和COX-2的阳性表达。显性失活的IκBα质粒可抑制细胞中NF-κB和COX-2的表达。