共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

超声辐照微泡促骨髓间充质干细胞修复大鼠急性肾损伤的实验研究

目的探讨超声辐照靶向破坏微泡促骨髓间充质干细胞（MSCs）修复大鼠急性肾小管坏死的作用。 方法选择40只SD大鼠构建急性肾小管坏死模型。将制备成功的40只急性肾小管坏死大鼠随机分为4组：单纯模型组、1.0 W/cm²超声辐照+微泡组（1.0 US+MB组）、干细胞组（MSCs组）、1.0 W/cm²超声辐照+微泡+干细胞组（1.0 US+MB+MSCs组）,每组各10只。1.0 US+MB组、1.0 US+MB+MSCs组大鼠均以强度为1.0 W/cm²及频率为1 MHz的超声辐照肾脏组织,并尾静脉输入0.5 ml造影剂,密度约为1.0×10⁸个/ml,辐照5 s,停5 s,共1 min。在急性肾小管坏死模型建立后第1天及第3天分别辐照1次。1.0 US+MB+MSCs组大鼠最后一次超声辐照完毕后1 min内经股静脉注入MSCs1 ml（密度为2.0×10⁶个/ml）。同时MSCs组大鼠经股静脉注入MSCs1 ml（密度为2.0×10⁶个/ml）。单纯模型组不做任何处理。MSCs移植7 d后将各组大鼠处死并取材,采用Western印迹法测定各组大鼠肾组织肝细胞生长因子（HGF）及表皮生长因子（EGF）蛋白表达并进行定量分析,采用HE染色观察各组大鼠肾小管坏死情况并进行评分。采用单因素方差分析比较单纯模型组、1.0 US+MB组、MSCs组、1.0 US+MB+MSCs组大鼠HGF蛋白表达水平、EGF蛋白表达水平、肾小管上皮细胞坏死评分差异,进一步组间两两比较采用SNK-q检验。 结果Western印迹结果显示,HGF在各组相对分子质量为84 000处均有特异性条带,EGF在各组相对分子质量为6 000处均有特异性条带,其中1.0 US+MB+MSCs组的条带最为明显。单纯模型组、1.0 US+MB组、MSCs组、1.0 US+MB+MSCs组大鼠HGF蛋白表达水平分别为0.16±0.30、0.35±0.50、0.37±0.50、0.70±0.60,EGF蛋白表达水平分别为0.19±0.40、0.41±0.50、0.43±0.50、0.82±0.70,肾小管上皮细胞坏死评分分别为（4.1±0.8）、（3.6±0.6）、（1.8±0.4）、（1.0±0.3）分。1.0 US+MB+MSCs组大鼠HGF蛋白、EGF蛋白表达水平均高于单纯模型组、1.0 US+MB组及MSCs组大鼠,且差异均有统计学意义（HGF蛋白：q值分别为23.6、18.7、9.6;EGF蛋白：q值分别为21.8、17.1、9.3;均P<0.05);1.0 US+MB+MSCs组大鼠肾小管坏死评分低于单纯模型组、1.0 US+MB组及MSCs组大鼠,且差异均有统计学意义（q值分别为20.1、16.7、6.9,均P<0.05),提示1.0US+MB+MSCs组大鼠肾小管修复情况优于其他各组大鼠。 结论1.0 W/cm²超声辐照微泡促进MSCs归巢并修复急性肾小管坏死,可为急性肾小管坏死提供一种新型的干细胞移植治疗方法。     

超声辐照微泡促骨髓间充质干细胞归巢于大鼠肾组织实验研究

目的 观察超声辐照微泡对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)归巢于急性肾小管坏死模型肾组织的作用.方法 将制备成功的40只肾小管坏死模型大鼠随机分为5组(8只),即(1)单纯模型组(对照组);(2)0.5 W/cm2超声+微泡组(0.5 US+MB);(3)干细胞组(MSCs); (4) 0.5 W/cm2超声+微泡+干细胞组(0.5 US+ MB+MSCs);(5)1.0 W/cm2超声+微泡+干细胞组(1.0 US+ MB+ MSCs).7d后将各组大鼠处死,取材用于荧光显微镜观察MSCs在肾组织的分布情况,采用荧光定量PCR测定细胞间黏附分子1(ICAM-1)基因表达水平.结果 采用荧光显微镜观察,DAPI标记的MSCs细胞核(细胞核带蓝色荧光),1.0 US+ MB+ MSCs组肾组织骨髓干细胞数量明显多于0.5 US+ MB+ MSCs组及MSCs组(P＜0.05).0.5 US+MB组、0.5 US+ MB+MSCs组及1.0 US+ MB+MSCs组ICAM-1的基因水平明显高于对照组及MSCs组(P＜0.05).结论 1.0 W/cm2超声辐照微泡促进肾组织细胞ICAM-1表达增加,从而促进MSCs归巢于急性肾小管坏死模型的肾组织.     

超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强小鼠肌肉基因转染的实验研究

目的 探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)对小鼠肌肉基因转染的增强效果.方法 30只Balb/c小鼠随机分为6组,每组5只.绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA (20μg)按下列分组与SonoVue微泡和(或)PEI混合,注入小鼠后肢胫前肌内,然后予以治疗性超声辐照(声强2 W/cm2,占空比50％,超声辐照声强与占空比在实验前予以优化).A组:PBS组(空白对照组);B组:质粒+ US;C组:质粒+MB+ US;D组:质粒+PEI组;E组:质粒+PEI+ US组;F组:质粒+PEI+ MB+US组.10d后处死小鼠,立即取小鼠双后肢胫前肌冰冻切片,荧光显微镜计数GFP阳性肌纤维数.组织同时送检石腊切片,HE染色光镜观察有无炎性损伤及坏死.结果 A组肌肉组织内未见明显绿色荧光;B组可见绿色荧光表达肌纤维,计数为(14±3)个;C组GFP阳性纤维个数(58±6)个,D组(96±7)个,E组(119±11)个,F组(158±18)个.F组的GFP阳性纤维数最多,与其他各组比较差异均有统计学意义 (P＜0.05).各组石腊切片未显示明显的炎症反应和坏死.结论 UTMD联合PEI可显著提高小鼠肌肉组织的基因转染效率.     

载自杀基因的靶向微泡联合超声辐照抑制视网膜母细胞瘤的实验研究

目的探讨载自杀基因的靶向微泡联合超声辐照对视网膜母细胞瘤(RB)的抑制作用。方法制备携带单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-tk)质粒和血管内皮细胞生长因子受体2抗体的靶向微泡,分为空白对照组、细胞+质粒组、细胞+质粒+Sono Vue组、细胞+靶向微泡组、细胞+质粒+超声辐照组、细胞+质粒+Sono Vue+超声辐照组及细胞+靶向微泡+超声辐照组进行实验。荧光显微镜观察各组基因转染情况,流式细胞仪检测转染率,加入丙氧鸟苷(GCV)后检测细胞的抑制率。结果细胞+靶向微泡+超声辐照组的转染率为(24.78±1.04)%,高于细胞+质粒+Sono Vue+超声辐照组(14.31±0.69)%,差异有统计学意义(P0.05)。随着GCV浓度的增加和培养时间的延长,各组抑制率逐渐升高。当GCV浓度为100 mg/L,培养96 h后,细胞+靶向微泡+超声辐照组对RB细胞的抑制率达(92.91±1.71)%。结论加入GCV后,携带HSV1-tk基因的靶向微泡联合超声能有效地抑制RB细胞。     

超声作用下CTGF-siRNA对大鼠肝纤维化基因治疗的实验研究

目的探讨利用超声微泡造影剂介导携带结缔组织生长因子-小干扰RNA(CTGF-siRNA)真核表达质粒转染大鼠肝细胞的有效性。方法 (1)构建CTGF-siRNA真核表达质粒;(2)将40只实验大鼠随机分为7组:正常组,实验对照组,CTGF-siRNA质粒组,超声联合微泡组,超声联合微泡介导基因低、中、高剂量组;(3)建立肝纤维化模型,基因治疗4周后处死大鼠,超声及病理切片HE染色评价肝纤维化程度,masson染色观察胶原纤维含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达。结果 (1)CTGF-siRNA基因治疗后超声及病理切片显示干预组纤维化程度降低;(2)masson染色显示超声介导微泡基因组胶原纤维含量表达量随着剂量增高而降低(P<0.05);(3)RT-PCR显示超声介导微泡基因组CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达明显低于其他组,且随着质粒剂量增大而减少(P<0.05)。结论超声微泡作用下CTGF-siRNA基因能特异地作用于靶位点,有效抑制肝纤维化进程,提高对肝纤维化干预的特异度。     

超声声学造影剂介导肝细胞生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声声学造影剂促进肝细胞生长因子(HGF)基因在大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)中的转染效果.方法 将HSC-T6接种在24孔板中,随机分为5组:①空白对照组(C);②单纯质粒组(P);③载基因超声声学造影剂组(M);④质粒+超声组(P+U);⑤载基因超声声学造影剂+超声组(M+U).荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率;MTT法检测该方法 对HSC-T6生长活性的影响;Western Blotting检测HGF蛋白的表达.结果 M+U组的绿色荧光强度及转染率均高于其他各组,并对细胞活性无明显影响,且HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05).结论 超声声学造影剂可提高基因在体外培养HSC-T6的转染效率,并对细胞活性无明显影响,为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略.     

超声破坏微泡对大鼠皮肤创面愈合影响的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡(声诺维)对大鼠皮肤创面愈合的影响.方法 96只SD大鼠建立皮肤创面模型后随机分成4组:超声破坏微泡组、单纯微泡组、单纯超声组和对照组.超声破坏微泡组经鼠尾静脉注射微泡造影剂0.5 ml,同时用声强度1 MHz、2.0 W/cm2超声辐照3 min单纯微泡组经鼠尾静脉注射微泡造影剂0.5 ml;单纯超声组经鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml,同样条件超声辐照3 min对照组经鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml.于创伤后第1、3、5、7、14、21 d利用HE染色和免疫组化方法 观察各组创面肉芽组织生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的情况.结果 HE染色:伤后第7 d,超声破坏微泡组肉芽组织明显比其他3组厚,新生毛细血管均垂直于创面生长,其他3组毛细血管排列紊乱.免疫组化观察VEGF表达变化:超声破坏微泡组在第3 d形成表达高峰,其他3组表达高峰在第5～7 d.结论 超声破坏微泡可以提高大鼠背部皮肤的创面愈合质量;新生肉芽组织成熟早,创面愈合加速.超声破坏微泡时产生的高温、高压及某些化学效应可以刺激内源性VEGF分泌,促进血管生成,从而促进创面愈合.

Abstract：

Objective To investigate the effect of microbubble(Sono Vue) destruction with ultrasound on wound healing in rats. Methods Total 96 SD rats were accepted one rounded whole-layer skin incision on back each other and randomly divided into four groups:microbubble destruction with ultrasound(US + MB),microbubble(MB), ultrasound(US) and control group. Rats in US + MB group were injected with 0.5 ml microbubble contrast agent via tail vein,and then ultrasound irradiated for 3 minutes immediately. MB group were injected with 0.5 ml microbubble contrast agent. US group were injected with 0.5 ml physiological saline,and then ultrasound irradiated for 3 minutes immediately under the same condition. Control group were injected with 0.5 ml physiological saline. Feed each rat in single cage. On day 1,3,5,7,14 and 21 after wound creation,the excised wound tissues were analyzed by histology and VEGF expression in wounds by immunohistochemistry. Results HE staining: On day 7, wounds of US + MB group displayed the most accumulation of granulation tissue and all new capillaries were perpendicular to the wound surface, but the new capillaries of other 3 groups were disordered. Immunohistochemical examination of VEGF expression:the peak expression appeared on day 3 in US + MB group, other 3 groups were on day 5 to day 7.Conclusions US + MB treatment could improve the quality of wound healing and granulation tissues were maturated earlier than MB, US treatment and control group, which could accelerate wound healing. High temperature,high pressure and some kind of chemistry effecs induced by microbubble destruction with ultrasound can stimulate the secretion of endogenous VEGF, which may be the mechanism of promoting angiogenesis and wound healing.     

超声辐照微泡介导脂质体小干扰RNA转染视网膜色素上皮细胞

目的 探讨超声靶向破坏超声微泡介导脂质体小干扰RNA(siRNA)转染视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值. 方法将人及大鼠RPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×10~5/孔、1×10~5/孔),分5组处理:siRNA+超声(US)、siRNA+微泡(MBs)+US、siRNA+脂质体(L)、siRNA+L+US、siRNA+L+MBs+US.12小时后,荧光显微镜观察并应用流式细胞仪测定阳性细胞比例. 结果在无脂质体的条件下,超声或超声联合微泡不能促进siRNA转染人及大鼠RPE细胞.siRNA+L+US组siRNA转染人RPE细胞效率最高.siRNA+L+US+MB组siRNA转染人及大鼠RPE细胞的效率显著低于siRNA+L+US组. 结论超声辐照可促进脂质体介导的siRNA转染人RPE细胞.     

超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。