正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的 对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法 基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg²⁺、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果 翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系（20 μL）为：Taq酶1.00 U、Mg²⁺ 1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.50 μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论 所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

头花蓼重复片段多态性分析-多聚酶链式反应体系建立与正交优化

目的: 建立头花蓼ISSR的反应体系。 方法: 通过正交试验,研究了Mg²⁺浓度、dNTP 浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度这4个因素在3个水平上对ISSR-PCR的影响。 结果: 确立了适合于头花蓼ISSR PCR的优化体系:25 μL PCR反应体系中含有1×buffer 缓冲液(10 mmol ·L^-1 KC1,8 mmol ·L^-1 (NH₄)₂SO₄,10 mmol ·L^-1 Tris ·HC1,pH 8.0),3.0 mmol ·L^-1 MgC1₂,d NTP 200 μmol ·L^-1,2.0 U ·25 μL^-1 Taq酶,0.25 mmol ·L^-1引物,40 ng ·L^-1模板DNA。利用温度梯度PCR,确定了最适宜的退火温度为48 ℃。 结论: 该优化体系的建立为进一步对头花蓼进行种质资源的遗传多样性分析奠定了基础。     

两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用

目的 采用ISSR-PCR方法对石斛属9种植物进行鉴别,探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异。方法 选取10条由SSR组成的引物,对9种石斛进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果 10条引物中有7条扩增出多态性条带。每条引物可检测的多态性位点最少7个,最多14个,扩增片段大小为220-1260 bp。其中,引物UBC-807和UBC-864具有较高的多态性条带比率,均可以独立将所有被测种区分开来。结论ISSR-PCR作为一种简便、可靠的分子标记鉴定技术,可以作为石斛属种间鉴别的方法之一。     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

利用ISSR-PCR方法分析单叶蔓荆居群的遗传多样性

目的:对山东和江西单叶蔓荆的4个居群80个样本进行资源考察和种内遗传变异情况分析。方法:利用ISSR分子标记技术。结果:从100条ISSR引物中筛选出15条特异性强、稳定性好的引物进行ISSR分析。共获得129个位点,其中多态位点数115个,多态位点百分率为89.15%。利用PopGene软件进行分析,结果表明居群之间的平均多态位点百分率为71.89%,Shonnon表型多样性指数(I)平均值为0.220 4,具有较高的遗传多样性。结合聚类分析和地理变异规律把种群划分为2个大的种群组:山东居群组和江西居群组。结论:以上结果可为单叶蔓荆种质资源的保护和利用以及物种分化研究提供依据。     

ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用

目的 采用ISSR-PCR方法对石斛属9种植物进行鉴别,探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异。方法 选取10条由SSR组成的引物,对9种石斛进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果 10条引物中有7条扩增出多态性条带。每条引物可检测的多态性位点最少7个,最多14个,扩增片段大小为220-1260 bp。其中,引物UBC-807和UBC-864具有较高的多态性条带比率,均可以独立将所有被测种区分开来。结论ISSR-PCR作为一种简便、可靠的分子标记鉴定技术,可以作为石斛属种间鉴别的方法之一。     

内蒙古道地黄芪种质资源遗传多样性分析

目的建立黄芪ISSR分析最佳反应体系,并分析内蒙古地区黄芪遗传多样性。方法采用单因素梯度浓度实验和正交试验相结合的优化方法建立稳定、可靠的ISSR反应体系;对内蒙古9个盟市30个不同居群的黄芪样本进行遗传多样性分析,用NTSYS2.1软件进行数据统计。结果 ISSR-PCR最佳反应体系(20μL):10×PCR缓冲液2.0μL、Mg Cl2 1.5mmol/L、d NTP 0.4 mmol/L、引物0.5μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U、模板DNA 40 ng;15条ISSR引物共检测到169个扩增位点,多态性位点157个,多态位点百分率为75%~100%,遗传距离变幅范围0.242 7~0.730 8,聚类分析可知,30个居群黄芪样本可分为2大类,大多数呈现地域分布规律。结论建立的黄芪ISSR-PCR反应体系稳定可靠;内蒙古地区黄芪具有较高的遗传多样性,种质间的亲缘关系与地理位置具有一定的关系。