通过定点诱变构建带有突变的载脂蛋白CⅡ启动子的表达载体

目的： 为研究载脂蛋白CⅡ启动子- 190处的碱基突变对其转录活性的影响,构建带有突变的载脂蛋白CⅡ启动子的表达载体。 方法： 以插入有正常ApoCⅡ启动子的质粒pGL 3为模板,设计一对带有预期突变的完全互补的引物,利用Stratagene的定点诱变试剂盒对ApoCⅡ启动子- 190处的碱基进行突变,扩增出带有缺刻的突变质粒,转化入XL- Blue超感受态细胞中修复缺刻。 结果： 成功地把ApoCⅡ启动子- 190处的碱基由T突变为A,构建了带有突变的ApoCⅡ启动子的表达载体。 结论： 用一种快速、高效的定点诱变方法,获得了带有预期突变的环状质粒,为进一步检测突变的载脂蛋白CⅡ启动子的活性奠定了基础。     

登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法

目的 对带有登革2型病毒（DEN-2）全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变。方法 设计4对点诱变引物,运用OL-PCR（overlapPCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆,将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203。对TB62和TB203进行序列测定。结果 成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆。结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法。     

PLAGL2对SP—C基因表达调控的作用靶点研究

目的 研究PLAGL2对SP—c基因表达调控的作用靶点。方法 定点诱变技术分别突变掉SP—C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6、7位锌指结构域序列并获得相应的突变体；凝胶电泳迁移实验研究PLAGL2及其突变体分别与SP—C基因启动子及其突变体之间的相互结合作用。结果 PLAGL2能与同位素标记的SP—C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物，而两者的突变体却不能与相应的蛋白或DNA片段发生相互作用。结论 PLAGL2通过其第6、7位锌指结构与SP—C基因启动子上PLAGL2的核心和簇结合位点序列相互结合从而实现对SP—C基因的表达调控。     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

目的：利用聚合酶链反应（PCR）技术对Wilson病（WD）基因进行体外定点突变的研究。方法：采用PCR定点突变技术，首先设计两对引物，将突变位点设计在引物上，通过重叠延伸法两次PCR扩增，扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。结果：DNA测序表明在预期位点已经发生突变，WD基因第778位密码子由精氨酸（Arg)残基突变为亮氨酸残基（Leu),用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。结论：PCR技术诱导定点突变准确，高效。Wilson病基因突变体的构建成功，为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

血型基因检测对照品的制备及其在三种稀有血型筛选中的应用

目的 应用基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的基因定点诱变技术(sitedirected mutagenesis,SDM)制备s、Oka血型等位基因检测对照品.用多重聚合酶链反应(multiplex PCR)技术建立3种血型Fy2、s和Ok2的基因分型方法,以了解这3种血型在中国随机献血者中的多态性分布状况.方法 采用基于PCR的基因定点诱变技术对s和Oka血型等位基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点构建了含有突变SNP位点(GYPB基因cDNA 153位C/T突变和BSG基因cDNA 274位G/A突变)的标准质粒,作为s和Oka血型等位基因检测的对照品.同时针对血型抗原Fya、s和Oka等位基因的SNP位点设计序列特异性(sequence specific primer,SSP)引物,构建多重PCR体系,对438份随机献血者样本进行Fya、s和Oka血型抗原的基因筛选.结果 成功应用定点诱变技术完成了s和Oka基因检测中等位基因对照品的制备,并建立了可同时检测Fya、s和Oka血型的多重PCR体系,438份随机献血者样本中共检出2例Fy(a-)样本,未检出s-和Ok(a-)样本.结论 基于PCR的基因定点诱变技术能够得到难以获得的血型基因检测等位基因对照品,用于验证基因分型方法.本实验建立的多重PCR体系是一种有效的进行Fya、s和Oka血型基因检测的方法.     

发生点突变的pCDNA3.1(+)质粒的构建

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造／优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入．可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构／结构域。常见体外定点突变的方法有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变、盒式诱变和基于PCR的诱变．以PCR为基础的定点诱变（site directed mutagenesis．SDM）技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法，广泛用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究。基于PCR的诱变方法有：重叠延伸PCR法、大引物PCR法等。     

重叠延伸PCR法构建UGRP1基因启动子的点突变表达载体

背景与目的:构建UGRP1基因启动子的定点突变表达载体.材料与方法:以插入UGRP1基因正常启动子的质粒pGL3-UGRP1(-112G)为模板,用重叠延伸PCR定点诱变技术,对-112位点的碱基进行定点突变,并构建定点突变表达载体.结果:DNA测序表明,UGRP1基因启动子-112处的碱基已由G突变为A,成功实现定点诱变.结论:重叠延伸PCR定点诱变技术高效、简便.pGL3-UGRP(-112A)的成功构建,为进一步研究-112G/A多态性对该基因转录活性的影响奠定了基础.     

新型粘膜免疫佐剂候选株LTAˉB+的构建

目的 :产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素 (LT)不仅是很强的口服免疫原 ,而且其粘膜免疫佐剂作用显著。LT的毒性限制了它的直接使用 ,希望通过体外定点诱变技术 ,获得具有粘膜免疫佐剂作用的LT减毒株。方法 :以人源LT基因为研究对象 ,首先构建了重组质粒 pUC19 LT ,然后用单引物PCR法和重叠延伸PCR法分别构建了LTQ7和K63基因突变体。结果 :CHO细胞体外试验和家兔肠结扎体内试验毒性测定的结果表明 ,LT突变体K63的毒性明显降低。结论 :K63有希望成为候选的高效粘膜免疫佐剂。     

重叠延伸PCR法构建β地中海贫血基因突变质粒标准品

目的:构建含β地中海贫血(简称β地贫)-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒标准品。方法:以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR(Overlap extension PCR,OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法分别构建含-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒。结果:DNA测序表明:重组质粒1的确含β地贫-28(A>G)突变基因,β珠蛋白-28处的碱基已由A突变成G,其余序列与野生型完全相同;重组质粒2的确含IVS-2-654(C>T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相。成功实现了定点诱变。结论:分别成功地构建了含β地贫-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒标准品,进一步为HRM技术检测β地贫基因突变方法的建立及该病其它基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础。     

PCR定点诱变方法构建BCR—ABLcDNA竞争性PCR内参照物

本实验通过合成与原有下游引物（Ｂ）相似的一条新引物（Ｂ’）,经聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）扩增出比原ＢＣＲ－ＡＢＬｃＤＮＡ序列减少了４个碱基的参照物,达到定点诱变的目的。经酶切分析证明,两型ＢＣＲ－ＡＢＬｍＲＮＡ均可通过此方法得到相应的ｃＤＮＡ参照物。参照物和特测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离,证明了其可行性。该参数物可用于慢性粒细胞白血