生长因子受体结合蛋白-2抑制肠癌细胞HT29增殖

目的 研究Grb2 shRNA转染对肠癌细胞HT29增殖相关信号通路的影响,探讨以Grb2为肠癌治疗靶点的可行性.方法 应用shRNA慢病毒质粒系统,将Grb2 shRNA转染至293T细胞,获得5株不同序列Grb2 shRNA慢病毒颗粒,并感染肠癌HT29细胞,分别获得的5株感染Grb2 shRNA慢病毒颗粒的肠癌HT29细胞系为实验组(即感染Grb2 shRNA的细胞HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-70、HT29/shGrb2-71、HT29/shGrb2-72、HT29/shGrb2-73),以eGFP shRNA慢病毒感染肠癌HT29细胞为阴性对照组.MTT法检测细胞增殖情况,RT-PCR检测Grb2 mRNA表达,Western blot检测Grb2、P42/44 ERK、磷酸化P42/44 ERK、Akt、磷酸化Akt(P-Akt)和STAT5等信号通路分子表达的改变.结果 感染shGrb2病毒72 h,HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73两株细胞在mRNA和蛋白水平均出现抑制现象.HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73细胞在感染后24h A值分别为0.176±0.045,0.186±0.013,感染48 h后为0.347±0.048、0.382±0.041均显著高于空白对照、阴性对照(P ＜0.001),72 h为0.934±0.038、0.983±0.205高于空白对照、阴性对照(P＜0.01);感染后72 h,phospho-P42/44 ERK、Akt、phospho-Akt明显下降,而ERK、STAT5表达不受影响.结论 在HT29细胞,Grb2 mRNA和蛋白水平上明显抑制,可诱导HT29细胞增殖和相关信号传导通路分子表达下调.     

白血病小鼠单倍型相合骨髓移植的归巢

背景:移植后造血干细胞的顺利归巢是单倍相合骨髓移植成功的关键.目的:构建小鼠白血病模型,进行单倍型相合的骨髓移植,动态观察受体小鼠体内移植细胞归巢率及不同时间点的归巢规律.设计、时间及地点:随机对照观察实验,于2005-11/2007-10在福建医科大学实验动物中心清洁级动物实验室进行.材料:供鼠为清洁级近交系C57BL/6小鼠和C57BL/6小鼠与BALB/c 小鼠杂交的雄性F1小鼠,受鼠为清洁级近交系雌性BALB/c小鼠,用于构建白血病小鼠模型.方法:将48只造模小鼠随机分为2组,对照组供鼠为C57BL/6小鼠,实验组供鼠为F1小鼠.实验组进行主要组织相容性复合物单倍型相合的同种异基因骨髓移植,对照组进行主要组织相容性复合物完全不相合的骨髓移植.主要观察指标:移植后1,2,3,4 d动态观察小鼠外周血、骨髓和脾中有核细胞计数,以流式细胞仪检测可与FITC标记的抗鼠H-2Kb单抗结合的供鼠阳性细胞并计算骨髓和脾归巢率.结果:对照组外周血中供鼠来源的细胞数持续下降,脾和骨髓的归巢率均为先升后降,提示供者来源的骨髓细胞在受鼠体内为先归巢再出巢;实验组外周血中供鼠来源的细胞数先下降,再持续上升,骨髓归巢率为下降后上升,脾归巢率为上升后下降,提示供鼠来源骨髓细胞在骨髓中表现为出巢后再归巢,脾中有延迟,与对照组比较,实验组第4天外周血中供鼠细胞数量及骨髓和脾归巢率均增高(P<0.05).结论:主要组织相容性复合物单倍体相合的骨髓移植的归巢规律是先出巢再归巢,归巢的细胞数量和归巢率高于主要组织相容性复合物完全不相合骨髓移植.     

IL-12诱导肝癌微环境中NK细胞活化发挥抗肿瘤作用

目的:探讨IL-12通过诱导肝癌微环境中NK细胞活化诱导抗肿瘤的效果。方法:NOD/SCID小鼠皮下注射肝癌HepG2细胞,成瘤后腹腔注射人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),建立HCC-huPBL荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分为IL-12组和PBS对照组,瘤内注射IL-12后,观测荷瘤小鼠瘤体积、体重、一般状况的变化,IL-12瘤内注射后第30天ELISA法检测荷瘤小鼠肝癌组织微环境中IL-12、INF-γ含量以及小鼠外周血中天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amin-otransferase,AST)及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的含量,免疫组化法检测IL-12治疗后肝癌微环境中NK细胞活化性受体NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46,以及抑制性受体KIR2DL3/CD158b、NKG2A/CD159a的表达。结果:第12、18、24、30天IL-12组荷瘤小鼠瘤体积均小于PBS组[(594.47±205.51)vs(832.10±187.49)mm3,(963.61±427.95)vs(1 350.87±468.23)mm3,(1 285.02±368.56)vs(1 975.49±655.54)mm3,(1 903.64±471.34)vs(2 568.77±784.68)mm3,均P<0.05]。IL-12组小鼠肝癌组织中IL-12与INF-γ的表达水平均明显高于PBS组[(2.96±1.02)vs(1.35±0.75)pg/ml,(12.26±4.11)vs(7.81±3.46)pg/ml,均P<0.05]。IL-12组与PBS组相比,血清ALT水平第7天显著升高[(73.85±10.71)vs(41.73±13.13)U/L;P<0.05],第14天达到高峰。IL-12组治疗后肝癌组织中NK细胞活化性受体NKG2D、NKp44、NKp30的表达较PBS组高(P<0.05),NKp46的表达未见明显升高;而NK细胞抑制性受体CD158b和CD159a表达较PBS组低(P<0.05)。结论:肝癌模型小鼠瘤体内IL-12注射可上调瘤组织内NK细胞活化性受体、IL-12、IFN-γ的表达,下调抑制性受体的表达,从而抑制小鼠模型中肿瘤的生长。     

NKG2D配体在中晚期食管癌患者术后NK细胞免疫治疗中的作用

  目的  探讨NKG2D配体MHC-I类相关分子A（MHC class I-related molecules A,MICA）在中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗中的作用。   方法  福建省肿瘤医院90例中晚期食管癌患者手术后,分为单纯化疗组40例、化疗联合NK细胞治疗MCIA阴性组（简称MICA-组）25例及化疗联合NK细胞治疗MICA阳性组（简称MICA+组）25例,比较其疗效。   结果  与单纯化疗组及MICA-组相比,MICA+组CD3+、CD4+T细胞阳性率、NK细胞阳性率及CD4+/CD8+比率明显高于治疗前[（64.2±6.4）% vs（51.3±5.6）%,（39.8±8.2）% vs（29.5±3.2）%,（25.3±2.1）% vs（16.4±4.3）%,（1.4±0.5）vs（1.1±0.7）;均P < 0.05],T-reg细胞明显低于治疗前[（6.3±4.5）% vs（17.3±2.4）%,P < 0.05]。3组疾病控制率及有效率无明显差异（P>0.05）。MICA+组KPS评分治疗后明显提高,MICA+组能明显改善化疗引起的白细胞减少、外周神经毒性症状,MICA+组疾病进展时间（time to progression,TTP）及总体生存时间（overall survival,OS）均明显延长（均P < 0.05）。但单纯化疗组及MICA-组之间差异无统计学意义（P>0.05）。   结论  食管癌组织MICA表达阳性的中晚期患者进行化疗联合自体NK细胞能有效能有效提高免疫力,改善患者生活质量,并能延长生存期,且回输安全、不良反应小。      

脐带血原始造血细胞的分析

虽然,有关人类造血干细胞的鉴定,目前还未找到直接鉴定的方法,但仍可从其表面的分子标记、集落形成情况等推断造血干细胞的存在。ＣＤ３４抗原表达于人类的造血祖细胞表面包括造血干细胞,因而是目前普遍用于估算造血干细胞含量的指标。然而骨髓大部分ＣＤ３４＋细胞除造血干祖细胞外,也可能是骨髓的基质细胞群,因此,人们借助于其它相关或特异性抗原的表达,联合ＣＤ３４的表达来确定ＣＤ３４＋组分中造血干细胞的含量。我们以脐血为研究对象,探讨了其间ＣＤ３４＋细胞上相关抗原的表达,以期对脐血中造血干祖细胞群做一较为全面的分…     

肝细胞肝癌组织浸润性淋巴细胞及其因子的表达

目的:分析原发性肝细胞癌(HCC)组织中浸润淋巴细胞的分类及细胞因子表达,探讨肝癌组织免疫微环境改变的意义.方法:收集76例原发性HCC的癌组织及非癌组织标本,应用流式细胞术及免疫组化的方法分别检测组织中免疫细胞的比例;运用流式微球阵列法(CBA)检测HCC组织和非癌组织中Th1/Th2类细胞因子,ELISA法检测TGF-1、VEGF的表达.结果:HCC患者中CD3+T细胞、CD4+ Th细胞、Treg细胞及CD455RO+记忆性T细胞在癌组织中的比例均高于相应的非癌组织,而CD8+ CTL细胞在癌组织中的比例较低;Treg细胞与Th细胞或CTL细胞水平呈负相关;癌组织中早期活化因子CD69在CD3+T淋巴细胞及NK细胞上的表达均低于非癌组织,而癌组织中晚期活化因子HLA-DR在CD3+T细胞表达的水平高于非癌组织.细胞因子IL-10、TGF-1及VEGF在癌组织中表达高于非癌组织.结论:肝癌组织微环境中,抗肿瘤效应性细胞比例下降,而抑制性细胞及其相关因子增加,引发肿瘤浸润淋巴细胞的免疫无能,导致肿瘤发生.     

人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较

目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.     

趋化因子受体CXCR4在乳腺癌中表达的研究

目的探讨趋化受体CXCR4在乳腺癌中的表达及其与肿瘤转移的关系,以及脂多糖(LPS)对其表达的影响.方法采用流式细胞仪和RT-PCR法检测23例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织、正常组织以及MDA-MB-231细胞中CXCR4在蛋白质和mRNA水平的表达情况,以及LPS对MDA-MB-231细胞 CXCR4表达的影响;用Transwell板检测经LPS作用前后MDA-MB-231对趋化因子SDF-1趋化活性的影响.结果乳腺癌组织MDA-MB-231细胞的趋化因子受体CXCR4在蛋白质和mRNA水平的表达均显著高于癌旁组织和正常组织(P<0.05),并且CXCR4的表达与乳腺癌的转移密切相关;脂多糖(LPS)能下调CXCR4的表达,经LPS作用后乳腺癌细胞趋化活性降低.结论趋化因子受体在乳腺癌的转移中起重要作用,下调乳腺癌细胞CXCR4的表达水平,可减少或抑制其转移.     

KIR不相合的NK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用

放化疗导致的淋巴细胞减少，改变了免疫细胞亚群的格局，启动了免疫细胞的内源性增殖，重建了一个新的免疫微环境。其机制主要与抑制肿瘤免疫的调节性T细胞比例与功能显著下调；内源性细胞因子IL-7、IL-15等供应增多，淋巴细胞高效扩增；抗原提呈细胞功能增强和以非对称性为特点的淋巴细胞自稳性增生的改变等相关。经历了淋巴细胞减少状态下肿瘤免疫格局的改变后，机体消除了抑制肿瘤免疫的重要因素，打破了肿瘤免疫耐受。肿瘤放化疗后选择合适时间点与生物治疗联合治疗，可以诱导出优于单一生物治疗的抗肿瘤效应，部分修正了以往认为放化疗导致的淋巴细胞减少不利于抗肿瘤免疫生物治疗的观念，为临床攻克肿瘤开辟新的治疗途径。