褪黑素通过激活自噬抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长和转移

目的 探讨褪黑素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和转移的作用及其机制。方法 将MDA-MB-231细胞设置对照组以及1、3、5 mmol/L褪黑素处理组,Western blot检测自噬对细胞生长、转移的影响时,添加3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合褪黑素组。使用不同浓度褪黑素处理MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48 h,并加入0.1%无水乙醇的细胞作为对照,CCK-8法检测细胞增殖活性确定最佳处理浓度和时间,筛选出3 mmol/L褪黑素用于后续实验。集落形成实验及划痕实验检测不同浓度褪黑素对乳腺癌细胞集落形成能力和迁移能力的影响;流式细胞术、免疫荧光检测3 mmol/L褪黑素对MDA-MB-231细胞凋亡率和自噬蛋白阳性着色情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl2、Bax,上皮-间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、Snai1的水平。结果 CCK-8结果显示,与对照组相比,褪黑素呈浓度及时间依赖性抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.05）;集落形成实验显示,3个浓度褪黑素处理组的集落数低于对照组;褪黑素作用24 h后明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合速度（P<0.01）,并诱导细胞凋亡率增加（P<0.01）;且与对照组相比,褪黑素组的促凋亡蛋白Bax表达增加（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调（P<0.05）,Bcl2/Bax的比值逐渐减低（P<0.01）;转录因子Snail减少,上皮细胞标志蛋白E-cadherin增加;单独使用褪黑素能够诱导细胞内自噬标记蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1表达增加,P62表达减少（P<0.05）以及Beclin1蛋白阳性着色增强,P62蛋白阳性着色减弱;3-MA+褪黑素组中自噬相关蛋白Beclin1（P<0.001）、LC3-ΙΙ/LC3-（Ι P<0.05）以及凋亡蛋白Bax（P<0.01）、上皮细胞标志蛋白E-cadherin（P<0.001）明显低于褪黑素组,抗凋亡蛋白Bcl2（P<0.05）、转录因子Snail以及Bcl2/Bax的比值（P<0.01）高于褪黑素组。 结论 褪黑素可通过诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞发生自噬,抑制乳腺癌细胞增殖、转移并促进其凋亡,而减少自噬,可减弱褪黑素对乳腺癌细胞生长和转移的抑制作用。     

Tet-on系统对胰岛细胞瘤中TRB3基因的表达调控作用

目的构建Tet-on系统可控表达TRB3基因的胰岛细胞瘤细胞株。方法通过Tet-on系统将TRB3质粒转染INS-rβ（r9）细胞中，经潮霉素筛选，克隆扩增得到可诱导表达TRB3基因的细胞系。采用实时定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western Blot检测该基因表达的可诱导性。结果三种检测方法都显示，500ng／ml DOX诱导48h可使转染的r9细胞中TRB3基因表达达到峰值，mRNA表达可上调60倍。结论通过本研究结果得到可控的TRB3高表达细胞株，为进一步研究该基因在胰腺肿瘤细胞中的功能提供了良好的细胞模型。     

白花檵木对肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用

目的 探讨白花檵木粗提物对肺腺癌A549细胞体外增殖的影响.方法 CCK-8法检测不同浓度白花檵木粗提物对A549细胞增殖的影响;集落形成实验检测白花檵木粗提物对A549细胞克隆生长能力的影响;流式细胞Annexin V-APC/PI双染法检测白花檵木粗提物诱导A549细胞凋亡的情况;免疫印迹法检测白花檵木粗提物处理后...     

人肝癌微血管内皮细胞黏附分子表达特点及其对外周血单个核细胞黏附和跨内皮迁移的影响

目的:研究人肝癌微血管内皮细胞(human liver cancer microvascular endothelial cell,HLCMVEC)上黏附分子表达的特点及其对免疫细胞黏附和迁移的影响.方法:分离培养HLCMVEC,以人肝窦内皮细胞系(liver sinusoid endothelial cell, LSEC)作为正常对照.通过细胞ELISA方法比较多种黏附分子在两种内皮细胞上的表达.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)用荧光染料BCECF标记,将其与HLCMVEC或LSEC共培养,随后采用倒置荧光显微镜和连续光谱荧光仪检测PBMC在两种内皮细胞上的黏附和跨内皮迁移能力;此外,共培养前分别预加各种黏附分子的功能抗体,然后分析各种黏附分子在PBMC与肿瘤微血管内皮细胞黏附和迁移中的作用.结果:HLCMVEC表达CD31、CD34和细胞间黏附分子-3(intercellular adhesion molecule-3,ICAM-3)的水平低于LSEC(P＜0.05),表达ICAM-1和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-l,VCAM-1)的水平明显低于正常LSEC(P＜0.01),但表达整合素αvβ3和αvp5明显高于LSEC(P＜0.01).PBMC在HLCMVEC上的黏附和趋化剂诱导下的跨内皮迁移均显著低于LSEC[黏附:(205.5±46.0) vs (330.5±48.4)个,迁移:(49.0±10.6) vs(110.0±19.2)个,均P＜0.01];该黏附和迁移可被ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1抗体明显阻断(P＜0.01),抗CD31抗体对黏附阻断不明显但能阻断跨内皮迁移(P＜0.05).结论:HLCMVEC特有的黏附分子表达特点抑制了PBMC的黏附和跨内皮迁移.     

人胚胎主动脉血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的研究人胚胎血管内皮祖细胞(EPCs)分离、扩增及鉴定的方法,并评价其分化成血管内皮细胞的能力,为人胚胎血管来源EPCs作为干细胞技术治疗疾病的细胞材料提供依据。方法从14周龄流产人胚胎主动脉中应用胶原酶消化法分离获得EPCs,用含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的低血清培养基体外扩增培养EPCs。分离培养的EPCs鉴定采用细胞免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞术,检测EPCs细胞的特异标志CD133、CD34和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)。培养的EPCs应用VEGF进行诱导分化,并评价其分化成为血管内皮细胞的能力。结果分离的人胚胎主动脉EPCs细胞表达EPCs的标志分子CD133、CD34和VEGFR2。EPCs在体外特定低血清培养条件下表现很强的增殖能力。培养的EPCs细胞经过VEGF诱导后,细胞表达CD133明显降低,表达vWF、CD31和ELAM-1增强,并且体外成管能力和摄取Ac-LDL能力增强,表明细胞分化成为血管内皮细胞。结论人胚胎早期主动脉的EPCs具有很好的体外自我更新能力和分化成为血管内皮细胞的潜能,可作为EPCs治疗疾病的细胞材料。     

同一组织来源的肝癌干细胞分化能力异质性的体外研究

目的通过比较肝癌干细胞的不同单细胞克隆的体外分化能力,分析同一组织来源的肿瘤干细胞分化能力是否具有异质性,以进一步明确肿瘤干细胞的分化特性,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供实验依据。方法通过有限稀释法对肝癌干细胞进行单细胞克隆培养,获得的单细胞克隆通过MTT测定比较其增殖能力。然后分别挑选增殖速度较快和较慢的3个克隆,采用RT-PCR方法比较其干细胞标志物表达水平。对干细胞标志表达水平高的3个克隆(A2、A3和B2)进行向成骨、软骨和脂肪方向的诱导分化。采用实时荧光定量PCR方法检测诱导前后成骨、软骨和脂肪标志分子的表达。结果获得的20个单细胞克隆增殖能力不同,并且增殖能力快的克隆表达干细胞标志物CD133、Oct4、c-kit、SCF、nestin比增殖能力慢的克隆强。向成骨方向诱导后,A2、A3和B2克隆I型胶原mRNA表达水平分别升高了(4.71±0.11)、(2.13±0.15)和(3.82±0.3)倍;骨钙素mRNA的表达水平分别升高(8.55±0.18)、(7.02±0.03)和(7.91±0.09)倍,说明A2克隆向成骨细胞分化能力最强。向软骨方向诱导后,B2分化能力最强,软骨标志分子蛋白聚糖和II型胶原的表达分别上调(25.01±0.19)倍和(17.49±0.19)倍,而在A2未发生明显变化,A3只轻微上调。向脂肪方向诱导后,A2、A3和B2克隆脂联素mRNA表达水平分别升高了(6.12±0.15)、(11.45±0.36)和(12.41±1.03)倍,过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA的表达水平分别升高(4.92±0.02)、(9.54±0.18)和(8.96±0.11)倍。结论来源于同一组织的肝癌干细胞在分化能力上具有异质性,这可能是导致肿瘤组织异质性的原因之一,也提示靶向肿瘤干细胞的治疗需要联合用药。     

大鼠胰岛素瘤实验模型的建立及其应用

目的 通过移植大鼠胰岛素瘤INS-1细胞至糖尿病小鼠肾包膜下使之形成胰岛素瘤,并诱导其发生凋亡,建立可用于研究胰岛β细胞凋亡机制的动物模型.方法 将5×106 INS-1细胞接种于链脲霉素(STZ)造模的糖尿病小鼠左肾包膜下,监测动物空腹血糖和血清胰岛素水平的变化,当血糖趋近正常后摘取动物左侧肾脏并检测其血糖和血清胰岛素水平的变化;固定包埋摘取的肾脏,进行HE染色以及胰岛素的免疫组化染色,确定胰岛素瘤模型的建立.在胰岛素瘤动物模型中,腹腔给予毒胡萝卜素(TG)或软脂酸钠(PA),监测给药后动物空腹血糖的变化,当血糖浓度出现逆转时,摘取动物左侧肾脏,通过TUNEL原位染色法检测移植瘤细胞的凋亡.结果 将INS-1细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下后,从第9天开始,动物空腹血糖进行性降低,血清胰岛素水平逐渐升高,当动物血糖接近至正常时,摘取动物左肾导致动物血糖显著升高,在摘取的左肾可见明显的移植瘤,免疫组织化学染色显示移植瘤细胞为胰岛素阳性.在胰岛素瘤动物模型给予TG或PA刺激后,动物空腹血糖出现逆转,显著升高,血清中胰岛素含量明显降低,摘取动物左侧肾脏后,TUNEL原位染色发现移植瘤内有明显的细胞凋亡.结论 大鼠胰岛素瘤INS-1细胞肾包膜下移植可以建立胰岛素瘤动物模型,应用此动物模型可以在体内研究胰岛β细胞凋亡的机制.     

糖基化终末产物上调人胰岛微血管内皮细胞黏附分子的表达和白细胞黏附

目的 研究糖基化终末产物（AGEs）对人胰岛微血管内皮细胞（HIMVEC）黏附分子表达和白细胞黏附的影响.方法 HIMVEC细胞在200 mg/L的AGEs刺激后,用细胞基础的酶联免疫吸附法（ELISA）和Western blotting法检测细胞表面黏附分子的表达;并与BCECF标记的白细胞共培养检测与白细胞的黏附能力.采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting分别检测HIMVEC细胞上AGEs受体（RAGE）、蛋白激酶Cβ（PKC β）和蛋白激酶A（PKA）的mRNA表达情况.随后给予PKC β抑制剂LY333531或PKA激活剂8-Br-cAMP,观察对HIMVEC黏附分子表达的影响及和白细胞黏附的影响.两组间比较采用t检验进行分析.结果 与对照组相比,AGEs处理后HIMVEC表达P选择素、E选择素和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）均上调（分别为1.10 ±0.13比0.64±0.14,0.83 ±0.06比0.47 ±0.05,0.87 ±0.09比0.43±0.07,t =4.93、9.40、7.61,均P＜0.05）,并且与白细胞的黏附较对照组明显增加（54 ±4比23 ±3,t=12.69,P＜0.05）.与AGEs组比较,RAGE抗体组P选择素、E选择素和VCAM-1的表达明显降低,组间差异具有统计学意义（t=5.69、6.89、5.43,均P＜0.05）.RAGE抗体组白细胞黏附明显少于AGEs组（54±4比31 ±4,t=8.22,P＜0.05）.与对照组相比,AGEs处理HIMVEC 4 h和18h,在mRNA水平和蛋白质水平均检测到RAGE和PKCβ的表达上调,但PKA的表达下调（t=10.94、7.76、21.82、5.85、10.96、11.47,均P＜0.05）.与AGEs组相比,在AGEs处理时给予PKCβ抑制剂LY333531或PKA激活剂8-Br-cAMP,均可降低HIMVEC上P选择素、E选择素和VCAM-1的表达水平（=7.60、6.60、6.25、11.58、4.08、3.47,均P＜0.05）,并减少白细胞的黏附（t=7.67、8.89,均P＜0.05）.结论 AGEs通过RAGE受体上调PKCβ和下调PKA增加HIMVEC上黏附分子的表达,促进白细胞的黏附,可能是糖尿病状态下胰岛中白细胞浸润的机制之一.     

甲磺酸阿帕替尼通过p53抑制结肠癌细胞HCT116增殖的作用及机制

摘要：目的 探讨阿帕替尼对人结肠癌细胞HCT116及敲除野生型p53的HCT116细胞抑制作用的差异并探讨 其机制。方法 以0、15、30、60 μmol/L阿帕替尼处理HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞24、48 h,以CCK-8法检测阿 帕替尼对两株细胞增殖的抑制作用;流式细胞术（Annexin V/PI法）检测0、15、30 μmol/L阿帕替尼处理细胞24 h后凋 亡率变化;实时荧光定量PCR法和Western blot法检测0、15、30 μmol/L阿帕替尼处理细胞24 h后,p53、NF-κB p65、 Caspase-3 mRNA和蛋白表达变化。结果 CCK-8结果显示,阿帕替尼能抑制HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞的增 殖,抑制作用具有剂量依赖性（P＜0.01）。流式细胞术结果显示,阿帕替尼干预后,HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞 凋亡率升高（P＜0.01）。与HCT116 p53+/+细胞相比,阿帕替尼处理后HCT116 p53-/-细胞的凋亡率较低（P＜0.05）。阿 帕替尼处理后,HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞中 p53、NF-κB p65、capsase-3 mRNA 和 Caspase-3 蛋白表达升高 （P＜0.05）。阿帕替尼干预后,HCT116 p53+/+细胞中 p53、NF-κB p65 蛋白表达下调而 HCT116 p53-/-细胞中 NF-κB p65蛋白表达上调（P＜0.01）。结论 阿帕替尼可能通过p53/NF-κB通路抑制HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞增殖 并促进细胞凋亡,结肠癌细胞可能通过野生型p53对阿帕替尼产生耐药。