阿的平诱导结外NK/T淋巴瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的：随着含有门冬酰胺酶化疗方案以及局部放疗和免疫检查点抑制剂的成功应用，结外NK/T细胞淋巴瘤［extranodal natural killer（NK）/T-cell lymphoma，ENKTCL］患者缓解率和无病生存率较以往有显著提高，然而仍有相当一部分进展期ENKTCL患者成为复发/难治性病例。前期研究发现，抗寄生虫小分子化合物阿的平可以抑制包括血液肿瘤在内多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，可能成为新型抗肿瘤药物。进一步探究阿的平对ENKTCL细胞的影响及其可能作用机制。方法：以不同浓度阿的平处理ENKTCL细胞系SNK6和NK92（分别由上海交通大学医学院附属新华医院血液内科和上海血液学研究所提供），观察细胞生长和形态并采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）检测其增殖，同时应用流式细胞术检测细胞周期、凋亡率以及细胞内线粒体跨膜电位和活性氧水平，进一步利用蛋白［质］印迹法（Western blot）检测细胞自噬相关蛋白LC3B和P70表达的变化。结果：SNK6和NK92细胞经阿的平处理48 h后，细胞增殖抑制率分别为（47.08±2.19）%和（30.46±7.95）%，明显高于对照组 ［（11.85±1.89）%和（10.08±2.01）%，P值均<0.05］，阿的平处理24 h后处理组SNK6和NK92细胞凋亡率分别达到（86.45±6.54）%和（76.5±10.8）%；显著高于对照组 ［（3.3±3.24）%和（2.64±1.67）%，P值均<0.05］。同时阿的平处理组SNK6和NK92细胞周期均发生明显S期阻滞，但细胞内线粒体跨膜电位均无显著变化。进一步研究还发现，阿的平能够促使SNK6细胞内活性氧水平升高并抑制SNK6和NK92细胞内P70蛋白磷酸化，同时上调LC3B蛋白表达。结论：阿的平能够诱导ENKTCL细胞增殖阻滞和凋亡，其机制可能与阿的平介导细胞内活性氧水平升高以及抑制mTOR信号通路进而激活细胞自噬有关。     

支气管哮喘患儿血浆中IL-9的检测及临床意义

目的检测支气管哮喘患儿血浆中白细胞介素-9(IL-9)的水平,探讨IL-9在支气管哮喘发生发展中的意义。方法收集支气管哮喘患儿和健康对照外周血标本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中IL-9和总IgE浓度。结果支气管哮喘急性发作期患儿血浆IL-9水平高于健康对照组(P0.05),而临床缓解组和健康对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。支气管哮喘急性发作期患儿血浆IL-9水平与总IgE浓度呈正相关。结论支气管哮喘患儿血浆中IL-9水平升高,与疾病的发生发展关系密切。     

人GITR基因的克隆和序列分析

目的:克隆人GITR基因全长编码区的cDNA,同时对其序列进行分析.方法:采用RT-PCR方法,从正常人外周血单个核细胞获得GITR基因的cDNA,克隆至pGEM-T载体,选择阳性克隆并进行序列测定.结果:扩增得到的人GITR基因编码区cDNA的全长726 bp,编码241个氨基酸残基,与GeneBank注册的序列完全一致.结论:获得人类GITR基因的克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。     

小鼠FoxP3基因腺相关病毒的制备与鉴定

目的:构建携带小鼠FoxP3基因的重组腺相关病毒,并检测其在NIH3T3细胞的表达情况。方法:将FoxP3通过内部核糖体进入位点(IRES)与报告基因增强型绿色荧光蛋白连接,构建同时含有目的基因和报告基因的重组腺相关病毒(rAAV)表达质粒,通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293细胞,收获并通过肝素亲和层析法纯化病毒,并对病毒纯度和滴度进行鉴定。利用携带FoxP3基因的重组病毒体外感染小鼠NIH3T3细胞,体外观察感染效率和目的基因转录情况。结果:包装成功的rAAV/FoxP3经纯化后获得了高纯度的rAAV/FoxP3,实时定量PCR检测rAAV/FoxP3的病毒滴度达到5.0×1012vg/mL,体外感染NIH3T3细胞,流式细胞术测定感染效率可达92.88%,实时PCR测定细胞内存在高水平FoxP3mRNA。结论:获得携带FoxP3-IRES-EGFP的rAAV,并可有效感染NIH3T3细胞,为进一步研究FoxP3的生物学功能提供了有效工具。     

人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的: 表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白, 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb).方法: 利用PCR从pGEM T-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列, 将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达融合蛋白, 通过Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔, 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化, ELISA法检测抗体效价, Western blot法检测抗体特异性.结果: 构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体, 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达, 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白, 蛋白浓度为400 mg/L, 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1:1.6×105, Western blot鉴定其具有良好的特异性.结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白, 并制备特异性pAb, 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础.     

幽门螺杆菌感染的胃黏膜组织硒含量的检测及其临床意义

目的研究幽门螺杆菌(HP)感染与胃黏膜组织硒含量关系。方法应用快速脲酶试验、WarthinStarry银染色确定HP感染;应用国标法检测组织硒含量。结果114例HP感染的胃粘膜组织硒含量平均为(2173±18858)μg/g;12例正常组织硒含量为(3.42±151)μg/g。硒含量在HP感染的胃粘膜病变组织中有不同程度的改变,尤以慢性浅表性胃炎患者为著,尽管随胃黏膜病变程度加重相对降低,但仍高于正常组织。各种HP感染胃粘膜组织的硒含量经两两比较,除伴异型增生(DYS)与胃癌(GC)外(P>005),其余各组均有显著性意义(P<005)。结论在HP感染的各种胃黏膜病变组织中,硒含量升高可能系对活性氧增加的保护性反应,一定浓度的硒可以防止HP对胃黏膜的损伤。     

三种外周血扩增CIK细胞方法的比较研究

目的 :比较三种方法扩增的外周血细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK细胞 )在增殖能力、细胞表型和细胞毒作用三方面的差异。方法 :用三种不同因子组合扩增CIK细胞 ,即IL 2组 :CD3单抗、IFN γ和IL 2 ;IL 1加IL 2组 :CD3单抗、IFN γ、IL 1和IL 2 ;IL 12组 :CD3单抗、IFN γ和IL 12。MTT法测定细胞增殖力 ,流式细胞术分析细胞表型 ,LDH释放法测定细胞毒作用。结果 :三种方法均可使细胞增殖能力显著增加 ,其中IL 12组促增殖能力及CD3+ 细胞所占比例低于另外两组 ,而CD5 6 + 细胞则多于另两组。IL 1和IL 2联合作用组CD4 + 细胞百分率高于其他两组 (P <0 .0 5 )。三种方法扩增的CIK细胞细胞毒性作用无明显差异。结论 :三种方法扩增的CIK细胞均可用于过继免疫治疗的研究。     

Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎模型IL-25表达水平的变化及意义

目的以Ⅱ型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎模型为研究对象,动态观察其IL-25的表达水平,探讨IL-25与关节炎发生发展的关系及其可能的机制,为寻找新的类风湿性关节炎免疫干预新途径积累实验数据。方法采用RT-PCR法扩增目的基因,构建mIL-25标准质粒,QRT-PCR检测模型鼠脾脏及其关节病变局部IL-25的表达水平;应用ELISA技术检测模型鼠血清和脾细胞培养上清IL-25蛋白的含量。结果在Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎的发病过程中,模型鼠脾细胞和关节滑膜组织IL-25的mRNA表达水平、均呈持续上升趋势,与对照小鼠相比差异显著(P<0.05)。这种IL-25蛋白和转录水平的表达,随着关节炎症程度的增加而升高。此外,模型鼠脾细胞对ConA的刺激表现出强IL-25表达性应答。结论 IL-25的表达水平与Ⅱ型胶原诱导的关节炎的发生发展密切相关。     

Graves病患者外周血单个核细胞GITR mRNA表达水平的变化和意义

目的探讨Graves病(GD)患者糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)mRNA表达水平的变化及意义。方法用实时荧光定量PCR法检测22例GD未治疗组、23例GD临床缓解组及18例健康对照组外周血单个核细胞(PBMC)GITR mR-NA相对表达水平;用化学发光法测定各组血浆中甲状腺激素水平,并评价GD未治疗组GITR mRNA相对表达水平与甲状腺激素水平的相关性。结果GD未治疗组GITR mRNA相对表达水平明显低于临床缓解组和健康对照组(χ2=18.48,P<0.01;χ2=18.26,P<0.01),而GD临床缓解组与健康对照组差异无统计学意义(χ2=0.12,P>0.05)。GD未治疗组GITRmRNA相对表达水平与FT3、FT4水平均呈负相关(r=-0.509、r=-0.483,P均<0.05),而与TSH呈正相关(r=0.458,P<0.05)。结论GD的发生可能与GD患者体内GITR基因表达下调有关。