紫檀芪诱导人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的细胞凋亡及其机制研究

背景与目的：紫檀芪是一种天然抗氧化剂,其抗视网膜母细胞瘤的效果仍不明确。拟探讨紫檀芪对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的细胞增殖、细胞凋亡及细胞自噬的作用,并初步阐明其作用机制。方法：采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法测定细胞的增殖活力,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,吖啶橙染色观察细胞内自噬囊泡的变化,蛋白［质］印迹法(Western blot)检测LC3B及P62蛋白的表达。结果：紫檀芪显著抑制WERI-Rb-1细胞的增殖活力(P<0.01),以25、50和100 μmol/L的药物浓度作用细胞24 h时,细胞增殖活力分别为(93.02±0.47)%、(55.10±2.04)%和(30.33±1.45)%;50 μmol/L紫檀芪处理细胞12、24和48 h时,细胞增殖活力分别为(88.38±3.70)%、(53.37±1.17)%和(29.60±1.05)%。紫檀芪显著诱导细胞凋亡(P<0.01),对照组、24和48 h细胞的凋亡率分别为(4.08±0.79)%、(13.44±2.12)%和(23.49±2.01)%。紫檀芪能够激活WERI-Rb-1细胞发生细胞自噬,上调LC3蛋白的表达,下调P62蛋白的表达,增加细胞内自噬囊泡的数量(P<0.01)。3-MA及Beclin1 siRNA抑制细胞自噬后能够部分逆转紫檀芪的抗肿瘤作用(P<0.01)。3-MA抑制细胞自噬后,紫檀芪处理组的细胞凋亡率为(12.97±2.09)%,3-MA+紫檀芪组为(8.35±1.11)%。siRNA敲低Beclin1后,紫檀芪处理组和siRNA+紫檀芪组的细胞凋亡率分别为(13.80±2.19)%和(9.62±0.52)%。结论：紫檀芪可以显著抑制WERI-Rb-1细胞的细胞增殖并激活细胞自噬促进细胞凋亡。     

ATG7对神经母细胞瘤增殖和耐药的影响及机制研究

摘 要：［目的］ 研究自噬相关基因ATG7对神经母细胞瘤增殖和化疗耐药性的影响,初步探索其分子机制,为神经母细胞瘤临床治疗提供新的线索和理论依据。［方法］ 在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和SK-N-BE2中,慢病毒转染敲减ATG7基因,采用MTT染色检测ATG7对细胞增殖能力的影响,同时通过Western blotting方法检测细胞内自噬标志性蛋白LC3表达量来反映细胞内自噬水平;通过检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白研究ATG7对细胞凋亡的影响。SH-SY5Y细胞经阿霉素处理后,采用实时无标记细胞分析仪连续监测细胞增殖情况,探讨ATG7在神经母细胞瘤耐药中作用。［结果］ 敲减ATG7基因能显著抑制细胞内自噬水平,而且ATG7敲减后细胞在第4、5d的增殖倍数分别为3.05±0.05和3.92±0.08,低于对照组的3.40±0.05和4.35±0.13（P=0.0012,P=0.0085）;与对照组相比,ATG7敲减组其凋亡抑制蛋白Bcl-2表达明显降低,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著升高（P<0.05）。经阿霉素处理后,ATG7敲减组细胞增殖率明显低于对照组（P<0.05）。［结论］ 由于ATG7基因介导细胞自噬过程,ATG7基因在神经母细胞瘤中可能通过自噬作用促进肿瘤细胞异常增殖,抑制细胞凋亡,进而增强细胞耐药性。     

NKX6.3对食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响及作用机制

目的 探讨NKX6.3对食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响及可能的作用机制。方法 人食管癌EC9706细胞分别转染NKX6.3（NKX6.3组）和空白质粒（miR-NC组），设空白对照组（Control组）。CCK-8法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞内活性氧、线粒体膜电位及细胞凋亡情况，Transwell 法检测细胞侵袭能力，Western blot检测增殖相关蛋白Ki67、侵袭相关蛋白（Vimentin、E-cadherin及N-cadherin），凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）的表达。结果 Control组、miR-NC组和NKX6.3组食管癌EC9706细胞中NKX6.3表达、细胞增殖能力、细胞内活性氧、线粒体膜电位、细胞凋亡及侵袭能力，以及Ki67、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.01）。其中，NKX6.3组NKX6.3表达量、细胞内活性氧，细胞凋亡率，Vimentin、E-cadherin、Bax及Caspase-3蛋白表达水平较miR-NC组升高；而线粒体膜电位、细胞增殖率、细胞侵袭数目、N-cadherin及Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.01）。结论 NKX6.3可抑制食管癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，该作用可能通过调控食管癌细胞中的增殖凋亡相关蛋白表达及活性氧水平实现。     

三氧化二砷联合环腺苷酸拟似物诱导骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的：近年来随着新型药物和免疫疗法的成功应用，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者的缓解率、缓解深度和无病生存率较以往显著提高，然而仍有相当一部分MM患者属于复发/难治性病例。我们的前期研究发现，环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）拟似物和三氧化二砷（arsenic trioxide，As₂O₃）可以抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡，成为MM治疗的新途径。该研究进一步探究As₂O₃单独和联合环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸［8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3’, 5’-cyclic monophosphate，8-CPT-cAMP］对MM细胞的影响及可能作用机制。方法：以不同浓度As₂O₃和8-CPT-cAMP单独和联合处理MM细胞系U266细胞，采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测其增殖，应用药物联合指数（combination index，CI）分析两药是否存在协同效应，同时采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率，进一步利用蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2表达的变化。结果：U266细胞经As₂O₃和8-CPT-cAMP单独或联合处理72和120 h后，联合用药组细胞增殖抑制率分别为（18.01±0.13）%和（28.01±0.14）%，明显高于单独用药组［As₂O₃组为（11.35±0.01）%和（16.01±0.14）%，8-CPTcAMP组为（12.26±0.30）%和（15.43±0.23）%，P均<0.05］；但两药联合处理U266细胞的CI值均大于1。联合用药组72和120 h后U266细胞凋亡率分别达到（22.26±0.13）%和（31.03±0.14）%，显著高于单药组［As₂O₃组为（10.06±0.01）%和（12.35±0.14）%，8-CPT-cAMP组为（13.26±0.30）%和（18.76±0.23）%，P均<0.05］。同时联合用药组U266细胞内caspase-3蛋白剪切活化和Bcl-2表达下降。结论：As₂O₃联合8-CPT-cAMP对MM细胞凋亡诱导效应强于单药，但无协同效应。     

氧化应激在姜黄素诱导肺癌细胞凋亡中的作用

摘 要：［目的］ 探讨姜黄素诱导肺癌A549细胞凋亡中氧化应激的作用。［方法］ 将不同浓度(5~40μM)的姜黄素作用于肺癌细胞株A549细胞,以MTT法检测姜黄素不同浓度（5~40μM）在不同时间点（3、6、12、24、48 h）对A549细胞的抑制增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率;DCFH-DA探针染色流式检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,硫代巴比妥酸法检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）,Western blot检测Bcl-2、Bax和HSP70的表达。［结果］ 20μM姜黄素作用细胞12h和24h时,细胞增殖抑制率分别为32.17% 和52.16%。姜黄素对A549细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性。A549细胞凋亡率和坏死率随着姜黄素的浓度增高而增加。经姜黄素处理后,细胞内活性氧显著性降低,丙二醛活性下降,HSP70活性下降,Bax/Bcl-2比值增高。［结论］姜黄素可调节肺癌细胞内氧化还原状态,从而促进肿瘤细胞凋亡。     

白藜芦醇通过自噬途径对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

摘 要：［目的］ 研究白藜芦醇（Resveratrol,Res）对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡效应,并从自噬角度探讨其机制。［方法］ 不同浓度Res及联合自噬抑制剂3-MA处理HepG2细胞。CCK-8法检测各组的细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;MDC染色后荧光显微镜下观察自噬形态;RT-PCR和Western blot检测Beclin1、Bcl-2 mRNA及蛋白表达。［结果］ Res可以显著降低HepG2细胞的存活率和诱导凋亡。Res诱导HepG2细胞发生自噬,Beclin1表达显著上调,Bcl-2表达显著下调;联合3-MA抑制自噬后,减弱了Res对HepG2细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。［结论］ Res可通过诱导HepG2细胞自噬发挥抑制增殖和促凋亡作用,其机制可能与作用于Beclin1/Bcl-2复合体有关。     

维生素E琥珀酸酯通过氧化应激诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的研究

目的：研究维生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate,VES）是否可通过氧化应激来诱导胃癌细胞凋亡及其可能机制。方法：分别用5、10和20μg/ml的VES处理胃癌SGC-7901细胞24h,同时设阴性对照组和甘露醇（活性氧抑制剂）预处理组。通过流式细胞技术、共聚焦技术和Western blot方法,检测了VES诱导SGC-7901细胞线粒体氧化损伤及细胞凋亡的情况,用相应的检测试剂盒检测细胞内活性氧和Ca^2＋含量变化情况。结果：不同浓度的VES对SGC-7901细胞均有诱导凋亡的作用。表现为随VES浓度的增加,SGC-7901细胞凋亡数量呈现增加的趋势,且SGC_7901细胞内活性氧含量及钙离子水平呈现增加的趋势,而线粒体膜电位逐渐下降。活性氧抑制剂甘露醇（1mmol/L）对VES诱导的胃癌细胞凋亡,和细胞内活性氧、钙浓度的增高及膜电位的降低均有显著抑制作用（P〈0.05）。随VES浓度的增加,SGC7901细胞内Bax蛋白的表达呈现上升的趋势,而Bcl-2蛋白的表达呈现下降趋势。甘露醇可显著降低胃癌SGC-7901细胞Bax蛋白的表达水平,同时增加Bcl-2蛋白的表达（P〈0.05）。结论：VES可显著促进胃癌细胞凋亡,并且随着VES剂量的增加,VES诱导胃癌细胞凋亡的作用越强。细胞内活性氧含量增加、细胞内钙超载所导致的线粒体氧化损伤作用可能是VES诱导细胞凋亡的机制之一。     

新疆家蚕抗菌肽与化疗药物联用对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究新疆家蚕抗菌肽（cecropin-XJ,CE-XJ）与4种化疗药物联用对人食管癌Eca109细胞增殖及凋亡的影响。方法：MTT法检测CE-XJ联合不同浓度的多柔比星（doxorubicin,ADM）、卡铂（carboplatin,CBP）、顺铂（cisplatin,DDP）和环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）对人食管癌Eca109细胞增殖的影响,流式细胞术分析CE-XJ与ADM、CBP、DDP、CTX联用对Eca109细胞凋亡、活性氧及线粒体膜电位的影响。结果：单独使用CE-XJ（1～50 μmol/L）可依剂量依赖方式显著抑制Eca109细胞的增殖（ P <0.05或 P <0.01）。CE-XJ分别与ADM、DDP、CTX联合用药, 与单独用药相比,Eca109细胞的增殖抑制明显加强、细胞凋亡率显著增加（均 P <0.05或 P <0.01）,细胞内活性氧水平显著增加（ P <0.05）,而线粒体膜电位显著降低（均 P <0.05）。但CE-XJ与CBP联用时出现拮抗现象,与单独用药相比,细胞增殖抑制变化不大,细胞凋亡率反而降低。结论：CE-XJ与化疗药物ADM、DDP和CTX联用对人食管癌Eca109细胞的增殖抑制和凋亡诱导有明显促进作用,其机制可能与细胞内活性氧和线粒体膜电位变化有关。但CE-XJ与CBP联用则起拮抗作用,其机制有待进一步探讨。     

辣椒素通过氧化应激诱导HepG2肝癌细胞凋亡的研究

摘 要：［目的］ 观察辣椒素对HepG2细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。［方法］采用CCK8法观察辣椒素对HepG2细胞增殖的影响,流式细胞术和JC-1探针检测辣椒素对HepG2细胞凋亡率和线粒体膜电位的影响,采用DCFH-DA探针联合高内涵分析仪检测氧化应激表达水平的变化。［结果］ 辣椒素可剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖、诱导细胞凋亡。200μmol/L辣椒素作用24h可引起HepG2 细胞明显坏死、脱落和漂浮。相比对照组,200μmol/L辣椒素明显降低HepG2细胞线粒体膜电位红绿荧光表达量比值（8.39±0.12 vs 4.23±0.04）。200μmol/L辣椒素可引起HepG2细胞内氧化应激水平上调1.78倍。使用还原剂维生素C抗氧化可恢复细胞活力,减轻凋亡。［结论］ 辣椒素剂量依赖性诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,其机制与氧化应激水平过激活相关。     

Akt抑制剂MK-2206清除衰老神经母细胞瘤细胞的实验研究

摘 要：［目的］ 探讨Akt抑制剂MK-2206清除衰老神经母细胞瘤细胞IMR-32的效果及可能机制。［方法］ 极光激酶A抑制剂MLN8237处理神经母细胞瘤细胞系IMR-32，利用衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测细胞状态、免疫荧光法检测组蛋白磷酸化和甲基化情况评估细胞衰老状况。CCK-8检测不同浓度MK-2206及MK-2206与MLN8237联合对IMR-32细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞凋亡状况。Western blot法检测MK-2206与MLN8237联合用药对IMR-32细胞 Akt、p-Akt、STAT3和N-Myc表达的影响。［结果］ MLN8237作用IMR-32细胞后，细胞核体积明显增大，细胞呈现大而扁平的衰老状态，细胞蓝染数显著增多；组氨酸 H3 Ser10磷酸化水平和组氨酸 H3 K9甲基化水平显著性升高。Western blot显示衰老IMR-32细胞内磷酸化Akt和STAT3蛋白显著性上调。10μmol/L MK-2206干预衰老细胞72h和96h后细胞存活率分别为（80.13±5.30）%、（74.29±4.06）%，较不干预衰老细胞组显著性下降。在MK-2206与MLN8237联合作用下细胞出现明显凋亡，凋亡率为（15.70±0.97）%，而不干预衰老细胞组细胞凋亡率为（8.81±1.33）%。同时两药联合组胞内p-Akt、STAT3和N-Myc蛋白显著性下调。［结论］ MK-2206可能通过抑制衰老神经母细胞瘤细胞内p-Akt，下调STAT3和N-Myc蛋白的机制，诱导细胞凋亡，从而达到清除MLN8237诱导的衰老细胞目的。     

缬沙坦对阿霉素所致心肌细胞损伤保护作用的初步研究

目的 研究缬沙坦（valsartan,VAT）对阿霉素（doxorubicin,DOX）所致心肌细胞损伤的保护作用。方法 采用不同浓度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L）DOX处理H9C2心肌细胞建立DOX心肌细胞损伤模型。CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化。结果 与对照组比较,不同浓度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L）DOX作用H9C2心肌细胞12 h和24 h,细胞存活率均随药物浓度增加而降低（P＜0.01）。其中1 μmol/L DOX作用24 h即可明显引起H9C2心肌细胞损伤,细胞存活率为（75.5±5.6）%,细胞凋亡率为（11.94±2.07）%,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;10 μmol/L的 VAT预处理H9C2心肌细胞24 h后可明显抑制1 μmol/L DOX引起的心肌毒性作用,与单用 DOX组比较,细胞存活率升高［（74.2±3.0）% vs （89.3±4.0）%,P＜0.01］、细胞凋亡率下降［（13.15±6.07）% vs （11.01±3.17）%,P＜0.01］、G₀/G₁期细胞所占比例明显减少［（69.21±2.03）%  vs （50.28±1.21）%,P＜0.05］。结论 VAT能抑制DOX所致的心肌细胞损伤,保护作用可能与其调控细胞凋亡有关。     

小干扰RNA阻断周期蛋白依赖激酶4对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

背景与目的：细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)是调控细胞周期进程的重要激酶之一,有实验报道其在子宫内膜癌中呈高表达,但是其在子宫内膜癌细胞中的生物学功能及其可能机制还不十分明确。本研究旨在通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默CDK4表达,并检测其对人子宫内膜癌HEC-1B细胞生物学行为的影响及其可能机制。方法：将化学合成的CDK4-siRNA转染至HEC-1B细胞;实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK4的mRNA表达量变化;Western blot检测转染前后细胞CDK4、视母细胞瘤基因(retinoblastoma gene,Rb)及其下游p-Rb的蛋白表达量的变化;分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡以及侵袭能力的变化。结果：转染后HEC-1B细胞中CDK4 mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01);抑制CDK4表达后,抑制HEC-1B细胞的增殖及侵袭,转染si-CDK4组细胞发生侵袭数为(117±21)个,而转染si-control组及未处理组分别为(269±39)个和(262±35)个,差异具有统计学意义(P<0.01);细胞转染后早期凋亡率为(21.7±3.5)%,较未处理组［(12.4±2.1)%］和si-control组［(11.8±1.9)%］明显增加(P<0.01);细胞周期分布发生变化,G₁期比例增加(P<0.01),S期细胞比例降低(P<0.01);进一步的Western blot结果显示,抑制CDK4表达后,细胞内p-Rb表达下降,但是总Rb表达无明显变化。结论：针对CDK4基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK4基因在子宫内膜癌细胞中的表达,抑制肿瘤生物学进程。     

miR-27a-3p对肝癌细胞化疗敏感性的影响及机制探讨

背景与目的：肝细胞肝癌是一种临床上常见的恶性肿瘤,由于其对化疗药物的耐受,常导致预后较差。microRNA（miRNA,miR）是一类长链非编码小RNA,参与肿瘤的多种生物学功能。miR-27a-3p作为代谢相关的miRNA被广泛地研究,而与化疗敏感性之间关系的报道较少。通过探讨miR-27a-3p参与肝癌化疗敏感性及其可能机制,为肝癌化疗提供新的理论依据。方法：应用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析miR-27a-3p在肝细胞肝癌患者癌组织与癌旁组织中的表达。采用Lipofectamine ^TM 3000脂质体瞬时转染方法,将miR-27a-3p过表达质粒和阴性对照质粒（miR-control）转染肝癌细胞株HepG2,将敲低质粒miR-inhibitor-27a-3p和阴性对照质粒（miR-inhibitor-control）转染PLC细胞,分别加入不同浓度的顺铂（cisplatin,DDP）处理48 h,采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白［质］印迹法（Western blot）技术检测磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B（phosphoinosmde-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路相关的蛋白表达。结果：miR-27a-3p在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织（P＜0.05）;在HepG2过表达细胞中,MTT结果显示,实验组miR-27a+DDP细胞对DDP的半数抑制浓度（IC ⁵⁰ ）为（1.02±0.03）μg/mL,较对照组miR-control+DDP（1.27±0.08）μg/mL、空白对照组+DDP（1.73±0.08）μg/mL均降低（P＜0.05）;细胞凋亡分析结果显示,实验组miR-27a+DDP的凋亡率［（31.03±0.20）%］显著高于对照组+DDP［（18.51±2.96）%］和空白对照组+DDP［（8.73±1.58）%］（P<0.05）;Western blot检测结果显示,miR-27a+DDP组的PI3K表达水平（0.28±0.01）较DDP组［（0.43±0.01）］、miR-27a组（0.57±0.11）及miR-control组（0.72±0.01）降低（P<0.05）;miR-27a+DDP组的p-AKT的表达水平（0.29±0.01）与DDP组（0.46±0.05）、miR-27a组（0.67±0.01）及miR-control组（0.10±0.01）相比明显降低（P<0.05）;而miR-27a+DDP组的C-caspase的表达水平（0.69±0.01）则高于DDP组（0.51±0.01）、miR-27a组（0.35±0.01）及miR-control组（0.18±0.01）,差异有统计学意义（P<0.05）。进一步将miR-27a-3p在PLC细胞中敲低,并于DDP中刺激培养,MTT、细胞凋亡和Western blot实验结果显示,与HepG2过表达细胞的结果趋势相反,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-27a-3p可能通过调节PI3K/AKT信号通路调控肝癌细胞株对DDP的化疗敏感性,有望成为增强肝癌DDP化疗敏感性的潜在治疗靶点。     

腺病毒介导的p16基因表达对体外细胞增殖和衰老的影响

Objective To investigate the influence of exogenous p16 expression on cell proliferation and senescence in normal and tumor cells. Method Genes encoding p16 and GFP were subcloned into an adenovirus vector,then recombinant adenovirus was produced in 293 cells and purified for subsequent infection into MEF and SMMC7721 cells. Cell proliferation was examined by CCK8 assay and senescence by SA-β-gal staining. Results The number of senescent MEF cells was much higher in cultures after infection with adenovirus expressing p16 than after infection with control adenovirus （15±5 vs 0 senescent cells/field）, and p16-expressing cultures showed significantly lower proliferation on days 1-4［（6.8±0.25）%,（10.6±0.68）%,（12.4±0.93）% and（45.7±1.13）%;P<0.01］. In contrast, no significant differences in proliferation or senescence were observed between control SMMC-7721 cultures or cultures expressing p16. Conclusion Expression of p16 alone is insufficient to induce cell growth arrest and senescence in tumor cells.     

CRISPR-Cas9敲除Notch1对CNE2细胞增殖及辐射敏感性的影响

背景与目的：Notch信号转导通路对鼻咽癌的发生、发展及维持肿瘤干细胞的自我更新等具有重要作用，既往研究方法难以使Notch通路中特定基因功能完全丧失。本研究旨在利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Notch1基因敲除的CNE2鼻咽癌细胞系，并观察Notch1敲除对CNE2细胞增殖、辐射敏感性的影响。方法：采用蛋白质印迹法（Western blot）检测人鼻咽癌细胞CNE2及鼻咽正常上皮细胞NP69中Notch1表达水平；利用sgRNA在线设计工具，针对Notch1设计sgRNA；利用PX459质粒构建含sgRNA的敲除载体PX459-Notch1-sgRNA；将质粒瞬时转染CNE2细胞，经过药物筛选、克隆化培养、Western blot检测、免疫荧光染色验证得到Notch1敲除的CNE2鼻咽癌细胞系；采用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测方法、克隆形成实验检测Notch1敲除组（Notch-KO）与未转染亲本组（Parental）、转染PX459空载体水平较的对照组（Ctrl）的增殖活性及辐射敏感性，并进一步采用流式细胞术检测侧群细胞比例。结果：与NP69细胞相比，CNE2细胞中Notch1蛋白水平较高；Western blot检测、免疫荧光染色验证Notch1基因被完全敲除。Notch1基因敲除可抑制细胞增殖活性（P<0.05）；Notch1-KO组的D₀、D_q和SF2值分别为1.160、1.881和0.630 Gy，低于Parental（1.176、2.533和0.824 Gy，P<0.001）和Ctrl组（1.182、2.516和0.819 Gy，P<0.001）；Notch1-KO中侧群细胞比例［（1.13±0.01）％］较Parental［（3.81±0.03）％］、Ctrl［（3.70±0.03）％］明显下降（P<0.001）。结论：运用CRISPRCas9技术可成功敲除CNE2细胞中的Notch1基因，Notch1基因敲除导致CNE2细胞增殖能力下降、辐射敏感性增加、侧群细胞比例降低。     

无充气耳后发际入路完全腔镜下甲状腺癌根治术效果初探

背景与目的：目前国内经耳后发际入路完全腔镜下甲状腺癌根治术鲜有报道。探讨该术式可行性及安全性。方法：2018年2月—2019年1月选取无充气耳后入路完全腔镜下和颈前切口甲状腺癌根治术各12例,比较两组临床特征、手术情况、术后并发症及美容满意程度。结果：腔镜组与开放组年龄、性别、肿瘤大小、住院时间、颈部疼痛、中央区淋巴结清扫数目相比,差异无统计学意义（P>0.05）;腔镜组平均手术时间［（88.1±13.8）min］较开放组［（60.4±9.4）min］更长,引流液总量［（134.2±62.0）mL］较开放组［（87.1±26.7）mL］更多（P=0.024）。腔镜组可获得更理想的美容满意度（P<0.01）。结论：无充气耳后发际入路完全腔镜下甲状腺癌根治术安全、可行,美容效果极佳,值得推广。     

葫芦素E对非小细胞肺癌细胞的生长抑制作用

目的:体外观察葫芦素E（cucurbitacin E,CuE）对非小细胞肺癌细胞系A549增殖的影响及分子作用机制。方法:采用MTT法检测不同浓度 CuE（0、1、10、100以及1000nmol/L）处理A549细胞24、48和72小时后的细胞增殖情况。流式细胞仪检测CuE对A549细胞凋亡的影响。 Western blot法检测被处理细胞中p-STAT3、p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Fas蛋白表达水平的变化。结果:CuE可显著抑制A549细胞的增殖（P＜0.05）,且呈时间和浓度依赖性。流式细胞仪检测显示随着CuE作用浓度的逐渐升高（0、100、200、400nmol/L）,A549细胞凋亡率由（4.63±0.70）%分别提高到（6.80±0.10）%、（20.53±0.49）%、（24.57±0.55）%,差异有统计学意义（P均<0.05）。Western blot结果显示CuE处理A549细胞,可降低p-STAT3、p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2蛋白表达水平,增强Fas蛋白表达水平,且上述作用随CuE浓度升高而增强。结论:CuE可显著抑制A549细胞的增殖并诱导凋亡,其作用机制与阻断STAT3和Raf/MEK/ERK信号通路,同时激活Fas信号通路有关。     

细胞因子IL-7与IL-15联合优化胃癌EBV特异性CTL细胞培养体系

目的:探讨细胞因子白细胞介素-7（IL-7）和IL-15在胃癌EB病毒（EBV）抗原特异性细胞毒性T细胞（CTLs）培养中较IL-2的优势。方法:提取胃癌患者外周血单个核细胞贴壁培养2 h,贴壁细胞加IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导树突状细胞（DC）,成熟的DC负载EBV抗原肽与T细胞混合培养,诱导EBV-CTLs,比较在细胞因子IL-2或IL-7/15培养条件下诱导的EBV-CTLs的扩增能力、表型、免疫应答及体外杀伤能力的差别。结果:与细胞因子IL-2相比较,IL-7联合IL-15培养的EBV-CTLs细胞中含有较高比例的CD3+ T细胞［（91.2±1.5）% vs （80.8±1.6）%,P=0.008 4］以及较高比例的CD3+CD8+ T细胞［（66.8±2.3）% vs （30.17±6.9）%,P=0.007 6］;在维持中央记忆性T细胞扩增方面,IL-7联合IL-15扩增的EBV-CTLs细胞中含有较高比例的CD8+CD62L+ T细胞［（26.4±2.3）% vs （9.6±1.4）%,P=0.003 6］及CD8+CD27+ T细胞［（38.5±3.7）% vs （16.7±2.9）%,P=0.01］;在免疫应答能力方面,接触DC负载抗原肽24 h后,IL-7联合IL-15培养的EBV-CTLs能分泌更多的γ干扰素（IFN-γ）,且CD137上调明显高于IL-2组;在体外杀伤实验中,IL-7联合IL-15诱导的EBV-CTLs对表达EBV抗原的靶细胞表现出更强的杀伤作用。结论:IL-7联合IL-15在扩增胃癌抗原特异性EBV-CTLs方面具有优势,扩增的细胞中含有较高比例的CD3+CD8+ T细胞,且能维持中央记忆性T细胞的扩增,表现出有更强的免疫应答和体外抗肿瘤效果,为其进一步临床个体化治疗 EBV阳性胃癌提供客观实验依据。     

机器人与腹腔镜手术治疗早期卵巢癌的临床比较

背景与目的：随着微创技术的迅速发展,机器人在妇科手术中应用愈加广泛。该研究比较了机器人手术及腹腔镜手术治疗早期卵巢癌患者的临床治疗效果。方法：回顾性分析了吉林省肿瘤医院2015年1月—2016年12月完成的Ⅰ期卵巢癌手术患者22例,其中机器人手术8例(机器人组),腹腔镜手术14例(腹腔镜组)。结果：两组患者均按手术计划顺利完成手术,机器人组的手术时间长于腹腔镜组［(194.50±10.90) min vs(178.71±10.58) min］,术中出血量少于腹腔镜组［(60.10±8.88) mL vs (73.71±12.99) mL］,术后24 h腹腔引流量少于腹腔镜组［(96.88±10.21) mL vs (108.00±11.43) mL］,差异均有统计学意义(P<0.05);两组的盆腔淋巴结清扫数、术后首次肛门排气时间、术后住院时间及术后发热等并发症比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：机器人手术与腹腔镜手术治疗早期卵巢癌无明显临床差异,安全、有效;机器人手术在早期卵巢癌患者的治疗中值得推广和应用。