载环孢素A海藻酸钙-壳聚糖微球的制备及体外释放特性

目的:针对角膜移植术后免疫抑制治疗需求,制备眼部局部给药的小粒径载环孢素A缓释微球,并进行体外释放考察。方法:以海藻酸钠、壳聚糖为载体材料,采用静电液滴工艺,通过向制备体系添加表面活性剂,制备小粒径载环孢素A微球,设计正交试验优化处方工艺,扫描电镜观察微球表面形态,动态透析法考察微球的体外释放特性。结果:所制微球形态良好,粒径分布窄,平均粒径为(12.4±0.8)μm,包封率为(82.8±1.8)%,载药量为(50.1±1.2)%,体外释放行为用Higuchi方程拟合效果最好。结论:采用静电液滴工艺,通过减小制备体系的表面张力,制备了球形度优良、粒径小、包封率和载药量较高的载环孢素A的壳聚糖-海藻酸盐缓释微球,所得制剂的体外释药规律服从扩散机制。     

山莨菪碱滴眼液对兔眼睫状肌及视网膜血流的影响

目的:研究山莨菪碱滴眼液对家兔眼睫状肌松弛和视网膜血流变化的作用,以探讨其防治近视的机制。方法:建立家兔离体睫状肌收缩模型,观察山莨菪碱滴眼液对乙酰胆碱诱导的收缩睫状肌的松弛作用;采用多普勒观察山莨菪碱滴眼液滴眼对家兔视网膜血流的影响。结果:山莨菪碱滴眼液对乙酰胆碱诱导的睫状肌收缩具有松弛作用;能够增加视网膜中央动脉收缩期和舒张期的血流,降低血管阻力指数。结论:山莨菪碱滴眼液通过松弛睫状肌,改善视网膜血循环发挥防治近视的作用。     

人角膜基质间充质干细胞外泌体的分离制备及鉴定

目的　制备人角膜基质间充质干细胞（human corneal stromal mesenchymal stem cells,HC-MSCs)外泌体并进行生物学鉴定。方法　采用组织块培养技术获得HC-MSCs,利用超速离心法从HC-MSCs培养上清中分离制备外泌体,通过蛋白免疫印迹、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法进行鉴定。结果　分离的纳米囊泡表达外泌体特异性标志蛋白CD63,CD81和TSG101,在透射电子显微镜下可见其呈圆形、卵圆形和杯盘状囊泡,直经113.3 nm。结论　从HC-MSCs培养上清中可分离出具有典型结构及特征的外泌体,为HC-MSCs外泌体的作用机制及其在眼科的转化应用研究奠定坚实的基础。     

异种去细胞角膜基质浸提液对CHL细胞毒性的实验研究

目的 通过鸵鸟去细胞角膜基质浸提液对中国仓鼠肺纤维细胞(CHL)毒性的实验观察,筛选出浸提液的最大无毒浓度,为进一步完成该去细胞角膜基质材料的染色体畸变实验奠定基础。方法 采用细胞培养的方法,将鸵鸟去细胞角膜基质材料制备成浸提液,用浸提原液、1:2,1:4稀释的浸提液与传代培养的CHL细胞共同培养,同时设立阴性、阳性对照,参考MTT比色法评价24 h后对细胞生长的影响。结果 1:4稀释的浸提液既无毒性,又具有促进细胞生长的作用。结论 采用CHL细胞进行细胞毒性试验,依据分级结果并结合细胞形态学特征可筛选出鸵鸟去细胞角膜基质浸提液进行CHL细胞染色体畸变实验的基准无毒浓度。     

HPLC与微生物检定法测定阿奇霉素滴眼液含量的比较研究

目的运用微生物检定法与HPLC法测定阿奇霉素滴眼液的含量,并比较其适用性。方法不同时间点抽取3个批号的阿奇霉素滴眼液,同时采用微生物检定法与HPLC进行检测阿奇霉素质量浓度。微生物检定法参照中国药典2005年版;HPLC法采用反相ODS-C18柱色谱柱,流动相为乙-腈0.1 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液(30∶70),流速为0.5 mL·min-1,柱温40℃,紫外检测波长为215 nm。结果室温留样观察12个月,经抗生素微生物检定法(效价法)检测,阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素含量下降了8.53%~12.39%;经HPLC检测,阿奇霉素含量下降了17.29%~23.50%。结论高效液相色谱法与微生物检定法相比差异较大,前者只适用于阿奇霉素的检定,微生物检定法更能准确的反映阿奇霉素滴眼液的抗菌活性,在应用时应根据具体情况选择合适的检定方法。     

人角膜基质间充质干细胞的分离培养及表型鉴定

目的 建立人角膜基质间充质干细胞(HCS-MSC)体外分离培养、传代和鉴定等方法。方法 无菌条件下,取眼科临床角膜移植术后剩余的供体角膜缘组织,去除上皮和内皮组织,将基质组织切成1mm×2mm的组织块,采用无动物源性血清的间充质干细胞培养液进行组织块贴壁法培养,倒置显微镜下动态观察细胞的生长形态及贴壁状态,将传代培养后的第三代细胞采用流式细胞分析法进行表型鉴定,液氮冷冻保存。结果 采用人角膜缘基质组织块贴壁法培养,于培养后第7天开始向周围呈放射状长出细胞,14天左右长满培养皿,细胞形态呈均一梭形; 传代培养后生长快速,于 2～4天达90%融合; 连续传代3次,其生长特性和形态不变,CD90,CD29和CD105阳性率>95%,CD34和CD-HLA-dr阳性率<3%。结论 采用人角膜缘基质组织可分离培养出间充质干细胞,为角膜组织修复、重建及对抗免疫排斥反应等奠定基础。     

荧光染色法在实验性异种角膜移植术后免疫诊断中的应用

目的:采用单克隆抗体间接免疫荧光法测定异种角膜移植术后不同时间点角膜组织中CD4,CD8T淋巴细胞的变化。方法:取正常兔角膜、腋窝淋巴结组织;鸵鸟-兔异种角膜移植术后1,2wk角膜组织,经甲醛固定,常规石蜡包埋切片脱蜡复水,胃酶消化法进行抗原修复,用鼠抗兔CD4,CD8单克隆抗体及荧光标记的羊抗鼠IgG进行免疫组化测定,荧光显微镜下观察角膜组织中CD4+,CD8+T淋巴细胞的表达。结果:鸵鸟-兔异种角膜移植后1wk角膜组织中CD4+,CD8+T淋巴细胞的表达为阴性,2wk时T淋巴细胞CD4呈强阳性表达,CD8呈阴性表达。结论:采用间接免疫荧光法测定动物异种角膜移植术后不同时间点局部角膜组织中CD4+,CD8+T淋巴细胞的表达,为异种角膜移植排斥反应机制研究及术后药物筛选奠定实验基础。     

复方倍他米松对异种角膜板层移植术后免疫排斥反应的影响

目的：观察结膜下注射复方倍他米松对鸵鸟-兔眼板层角膜移植术后免疫排斥反应的缓释治疗作用。

方法：16只6周龄健康新西兰白兔角膜(单眼)行板层角膜移植术,植片应用鸵鸟脱细胞的角膜基质,术后分成两组,实验组术毕及术后结膜下注射复方倍他米松注射液(每隔7d一次),对照组术毕及术后结膜下注射地塞米松磷酸钠注射液(每隔7d一次)。分别于术后1、2wk, 1、2mo取兔角膜组织做石蜡包埋切片,进行HE染色观察组织特点,同时进行间接免疫荧光法检测CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞的变化。

结果：术后2mo,实验组角膜植片在位,并保持透明,新生血管极少,组织切片HE染色和间接免疫荧光染色结果显示,仅见少许中性粒细胞浸润,未见CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞; 对照组炎症反应明显,角膜植片混浊,组织切片HE染色和间接免疫荧光染色结果显示,炎性反应以中性粒细胞浸润为主,可见CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞。

结论：复方倍他米松作为长效缓释剂可有效抑制鸵鸟-兔板层角膜移植术后免疫排斥反应,延长植片的存活时间。     

原发性翼状胬肉患者泪液中TNF-α和IFN-γ的表达

目的：检测原发性翼状胬肉患者泪液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)的含量,探讨翼状胬肉发生的泪液机制。

方法：用酶联免疫吸附方法(ELISA)对单眼原发性翼状胬肉患者60例60眼(静止期组30例30眼、活动期组30例30眼)和正常对照组健康志愿者30例30眼泪液中TNF-α、IFN-γ的含量进行定量测定,并进行统计学分析。

结果：原发性翼状胬肉患者患眼泪液中TNF-α、IFN-γ的含量与正常对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。原发翼状胬肉患者患眼泪液中TNF-α含量均高于正常对照组,而IFN-γ含量均低于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：泪液中TNF-α、IFN-γ含量的变化在促进翼状胬肉的发生发展中可能发挥重要作用,为原发性翼状胬肉的药物治疗提供了新思路。     

HPLC测定房水及血液中环孢霉素A浓度的实验研究

目的建立一种新的反相高效液相色谱法(RP-HPLC),用于测定房水及全血中的环孢霉素A(CsA)浓度。方法RP-HPLC测定房水及全血中的CsA浓度:ODS-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(70∶30);柱温60℃;检测波长210nm。结果采用乙腈-水-正己烷-甲醇的处理方法,CsA的峰面积与其浓度具有很好的线性关系:Y=339.2 X+4505.2,r=0.9991,CsA线性范围为62.6～626μg·L-1,最低检测浓度50μg·L-1,回收率98.7～103.6%,日内和日间变异系数小于4.0%,兔房水CsA浓度为144～466μg·L-1;大鼠全血CsA浓度在210～600μg·L-1。结论该样品与处理方法及HPLC检测方法简单、准确、经济,干扰少,可用于CsA的房水及血药浓度检测。