人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响

目的构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响。方法采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE。经测序检测后,用PmeI酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。经PacI酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒。利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度。用Western blot检测目的基因的表达。采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响。结果成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体。Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达。收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL。转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少。结论hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用。     

内皮素1及其受体在良性前列腺增生中的表达

目的 探讨内皮素1（ET-1）及其受体（ETAR与ETBR）在良性前列腺增生（BPH）移行区组织中表达的意义。方法 采用免疫组化及Western blot技术检测5例正常前列腺组织（NP）与16例良性前列腺增生组织中ET-1及其受体表达。结果 良性前列腺移行区组织中ET-1与ETAR表达明显高于正常前列腺组织。结论 ET-1及其ETAR参与了良性前列腺增生的病理生理过程。     

吡咯喹啉醌对UVA诱导人皮肤成纤维细胞衰老的保护作用及机制研究

目的:研究吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)对UVA诱导人皮肤成纤维细胞衰老的保护作用及其机制?方法:体外使用6孔板培养人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblasts,HSF),予以9 J/cm2照射,照射前后实验组加入80 ng/ml的8-甲氧基补骨脂(8-methoxypsoralan,8-MOP)和浓度为50?100?200 ng/ml的PQQ?UVA照射72 h后,对细胞进行衰老β-半乳糖苷酶染色?JC-1染色荧光显微镜检测线粒体膜电位变化?JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜去极化状况?real-time PCR检测衰老相关基因mmp1?mmp3的表达?结果:低剂量PQQ(50 ng/ml)实验组β-半乳糖苷酶染色呈阴性,JC-1染色后低剂量PQQ(50 ng/ml)实验组细胞线粒体膜电位改变的趋势有回转,JC-1染色后流式细胞仪检测PQQ对UVA诱导的衰老细胞线粒体去极化有保护作用,而且低剂量PQQ(50 ng/ml)实验组衰老相关基因mmp1?mmp3的表达也有明显降低?结论:吡咯喹啉醌对由UVA诱导的人皮肤成纤维细胞衰老有保护作用,而且这一作用可能是通过线粒体途径发挥作用的?     

肝癌相关新基因HC6的全长cDNA克隆及分析

目的：染色体17p13.3区域内多态性位点D17S926是肝细胞肝癌（HCC）杂合性缺失热点,PAC579克隆含有D17S926位点,本实验目的在于从PAC579克隆中寻找与肝癌相关的表达序列（ESTs),对有意义的EST片段克隆其全长cDNA。方法：根据PAC579克隆中现有的9个代表新基因的 EST序列设计引物,对正常人肝cDNA文库作多聚酶链式反应（PCR）扩增检测,确定在肝组织中表达的EST,然后采用Southern杂交检测肝组织中表达的EST在27对肝癌和癌旁标本中杂合性生缺失（LOH）频率,选择缺失频率最高的EST克隆其全长cDNA,Nothern杂交验证后测序并作进一步分析。结果：PAC579现有9个代表新基因的EST中有3个在肝组织中表达,其中EST6有肝癌中LOH频率高达54．6％（6／11）,通过PACE－PCR方法,得到约1．8kb全长cDNA克隆,与Northern杂交结果一致,结构及同源性分析显示该基因是一新基因,编码一个包含134个氨基酸,分子量约为14．7kD的蛋白质,另外发现碱基序列313－592属于ALu同源序列,重新命名为肝癌相关基因6（HC6）。结论：通过定位克隆方法从肝癌杂合性缺失热点得到一个新基因HC6,该基因与肝癌的关系有待进一步研究。     

半定量RT—PCR方法检测肝癌相关cDNA克隆的表达

肝癌是我国常见的恶性肿瘤 ,研究其分子水平发病机制对预防及治疗该肿瘤有着重大现实意义。人类基因组 17ｐ13.3在肝癌组织中存在高频率的杂合性缺失 (ＬＯＨ) [1] ,提示该区段含有与肝癌发生发展相关的抑癌基因。采用该染色体区段内的人工酵母染色体 (ＹＡＣ)、人工细菌染色体 (ＢＡＣ)筛选人正常肝ｃＤＮＡ文库及外显子捕获 (ｅｘｏｎｔｒａｐｐｉｎｇ)方法 ,本实验室已找到若干该区域内的ｃＤＮＡ克隆[2 ] ,但这些表达序列与肝癌发生的关系尚未阐明 ,检测这些表达序列在肝癌和癌旁中的表达差异性无疑是寻找这种相关性的一种有效方法。材…     

MicroRNA-140在乳腺癌细胞中对Nrf2及其下游抗氧化基因的表达调控

目的 本研究旨在揭示microRNA在乳腺癌细胞中对Nrf2表达的影响.方法 利用生物信息学方法预测miR-140与Nrf2的结合位点,然后采用双荧光报告系统检测miR-140对Nrf2 3′UTR及启动子上的8×ARE区域活性的影响;同时以实时荧光定量PCR法和Western bloting法检测过表达miR-140和加药刺激前后细胞中Nrf2及其下游基因的mRNA和蛋白的表达变化;最后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染miR-140后,对于不同浓度H2O2处理的细胞,观察其生长能力及对氧化应激敏感性的变化.结果 过表达miR-140能够显著抑制Nrf2 3′UTR区域的表达(P =0.007)和启动子上ARE区域的活性(P=0.01);在过表达miR-140的对照组和加药组细胞中,Nrf2及其下游基因mRNA和蛋白水平均被明显抑制(均P＜0.05);MTT实验结果显示转染miR-140细胞活力受到抑制,同时再使用不同浓度的H2 02刺激细胞后,细胞对氧化应激的敏感性增加(P＜0.01).结论 Nrf2可能作为miR-140的一个新型靶基因,miR-140能够通过抑制Nrf2,进而影响其下游一系列抗氧化基因的表达.     

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景：Dlxin 1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T 1/2)向成骨细胞分化。 目的：对C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin 1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探。 设计、时间及地点：细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成。 材料：C3H10T 1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备。 方法：用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin 1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位。 主要观察指标：①细胞中Dlxin 1基因mRNA的表达情况。②pGL3-Dlxin 1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T 1/2细胞核蛋白的结合能力检测。 结果：在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin 1基因表达上调;Dlxin 1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943 ~-728 bp之间;EMSA证实,-758 ~ -748 bp这一片段是调控核心区域。 结论：转录因子通过与Dlxin 1启动子上游TATA box结合来调控Dlxin 1基因的转录。     

HepG2肝癌细胞STAT3与β-catenin形成复合物及其功能研究

目的：研究STAT3与β-catenin信号转导途径的相互关系。方法：利用细胞的免疫组化双色染色和蛋白免疫沉淀的方法探讨STAT3和β-catenin是否形成复合物。利用荧光素酶活性分析的方法研究STAT3与β-catenin功能上的相互影响。结果：HepG2细胞中STAT3和β-catenin在位置上存在共同分布。STAT3与野生型、突变型的β-catenin均可在HepG2细胞中形成复合物。在研究复合物功能时发现，随着细胞密度的增加，STAT3与野生型β-catenin形成的复合物含量减少。但STAT3对β-catenin转录激活活性未发现明显的影响。结论：STAT3与β-catenin形成复合物的结果表明STAT3信号途径与β-catenin信号途径之间很有可能存在着一定的内在联系，为今后进一步研究肝癌的发生机理提供了新的思路。     

MicroRNA-140靶向组蛋白去乙酰化酶7基因及在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中的表达分析

目的检测组蛋白去乙酰化酶7（HDAC7）是否为MicroRNA（miRNA）-140的靶基因,并研究在大鼠骨髓间充质干细胞（ratMSCs）成软骨诱导分化中miRNA-140和HDAC7表达的相关性。方法利用生物信息学、双荧光素酶报告基因检测以及Western blot法鉴定miRNA-140与HDAC7之间的靶作用关系。选取4周龄Sprague—Dawley（SD）雄性大鼠采用全骨髓贴壁法进行体外分离培养纯化得到大鼠骨髓间充质干细胞并向成软骨方向诱导分化,同时采用实时定量PCR和Western blot法检测miRNA-140和HDAC7的表达水平。结果双荧光素酶活性分析结果提示,miRNA-140靶结合人HDAC7基因的3’UTR。将miRNA-140mimics转染大鼠骨髓间充质干细胞后抑制HDAC7的蛋白表达。在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中,miRNA-140表达上调,而HDAC7表达下降。结论miRNA-140通过靶结合HDAC7基因的3’UTR抑制HDAC7表达,二者在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中表达负相关,提示miRNA-140通过抑制HDAC7蛋白表达保护软骨组织。     

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景:Dlxin 1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T 1/2)向成骨细胞分化.目的:对C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin 1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成.材料:C3H10T 1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备.方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin 1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位.主要观察指标:①细胞中Dlxin 1基因mRNA的表达情况.②pGL3-Dlxin 1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T 1/2细胞核蛋白的结合能力检测.结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin 1基因表达上调;Dlxin 1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728 bp之间;EMSA证实,-758～-748 bp这一片段是调控核心区域.结论:转录因子通过与Dlxin 1启动子上游TATA box结合来调控Dlxin 1基因的转录.