流体剪切应力对晚期内皮祖细胞生物学功能的影响

目的 研究流体剪切应力处理对晚期内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）体外及体内生物学功能的影响。 方法 密度梯度离心法分离大鼠骨髓单核细胞,应用EGM-2MV进行体外培养。以3~4代的EPCs,即晚期EPCs为靶细胞,对其施以1.2 Pa剪切应力处理。采用EdU标记技术、黏附能力测定实验、改良的Boyden小室、Annexin V/PI、β 半乳糖苷酶检测法、Matrigel法、荧光定量RT PCR等方法分别检测剪切应力对晚期EPCs增殖、黏附、迁移、凋亡、衰老、体外成血管及VEGF mRNA表达等生物学功能的影响。应用大鼠颈动脉损伤模型及细胞原位移植等实验手段检测剪切应力预处理对晚期EPCs修复受损内皮的影响。结果1.2 Pa剪切应力处理可不同程度提高晚期EPCs的增殖、黏附、迁移及成血管能力（P＜0.01）,上调VEGF的基因表达,抑制晚期EPCs的衰老及凋亡（P＜0.01）;移植经剪切应力预处理的晚期EPCs可加速损伤内皮的修复,减缓内膜的增生。结论 流体剪切应力可改善晚期EPCs的功能活性,提高晚期EPCs修复损伤血管内皮的能力, 这为EPCs的临床应用及剪切应力介导的细胞疗法提供了实验依据。     

岩藻黄素在振荡剪切应力致EPCs功能改变及衰老中的影响作用

目的 探讨岩藻黄素（Fucoxanthin, FUCO）对振荡剪切应力作用下内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）生物学功能及细胞衰老的影响作用。方法 采用Flexcell STR-4000平行板流动系统模拟体内扰动流剪切应力（振荡剪切应力,Oscillatory shear stress,OSS,± 4 dynes/cm2,1 Hz）并加载于EPCs;利用结晶紫染色法观察OSS作用后EPCs的形态学改变;应用Boyden小室、自发性细胞贴壁及Matrigel基质胶分别检测细胞迁移、粘附和体外血管形成能力的变化;采用Western Blot检测促沉默信息调节因子1（Silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1）蛋白和β-半乳糖苷酶法检测细胞衰老程度的改变;通过Dihydroethidium（DHE）荧光探针法检测细胞内超氧化物阴离子。结果 与静态培养组相比,OSS导致EPCs形态学发生明显改变,表现为细胞长宽比降低,细胞之间间距增加;而FUCO对OSS导致的EPCs形态学改变无显著影响作用;与OSS处理组相比,FUCO可显著促进EPCs的迁移（10.00±1.73 vs 21.00±2.65个/视野）、粘附（8.00±1.00 vs 20.00±1.73个/视野）及体外血管形成能力（8538.67±1231.47 vs 11009.33±570.08像素/视野）。进一步研究发现,FUCO可降低OSS导致的β-半乳糖苷酶阳性细胞比例（21.18±1.38% vs 12.69±3.94%）以及促进SIRT1蛋白表达上调;同时,FUCO可减弱OSS诱导的EPCs胞内超氧阴离子的产生（P<0.05）。结论 FUCO可缓解OSS环境下引发的EPCs细胞功能降低、细胞衰老的发生,提示其可有效提升内源性EPCs的血管修复能力。     

β-synuclein真核表达载体的构建

目的克隆人β-synuclein基因并构建真核表达载体pcDNA3．1-β-synuclein,为帕金森病发病机制的研究奠定基础。方法从人胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带β-synuclein基因的表达载体pcDNA3．1-β-synuclein。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了β-synuclein真核表达载体peDNA3．1-β-synuclein;该载体可用于帕金森病的相关研究。     

肝复康不同浓度含药血清对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及细胞基质的影响

背景：既往的动物实验已多次证实了肝复康对肝纤维化组织具有预防及治疗作用。目的：观察中药肝复康不同浓度含药血清对肝星状细胞T6细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、a-平滑肌肌动蛋白和金属蛋白酶组织抑制因子1基因表达的影响，以及探讨其抗纤维化的作用及分子机制。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07／2006—07在大连医科大学病理生理学教研室完成。材料：清洁级SD大鼠25只，体质量300～350g，用于制备含药血清；鼠肝星状细胞T6细胞株由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠；中药肝复康由柴胡、当归（补血合血）、黄芪（益气）、赤芍、白芍（活血化瘀）、丹参（活血化瘀）等组成。方法：按肝复康高、中、低剂量（8．32，4．16，2．08mL／只）灌胃制备药物血清。实验分为5组，空白对照组：加含体积分数0．1正常对照血清的DMEM；模型对照组：加含体积分数0．1正常对照血清＋60ug／L血小板衍生生长因子的DMEM；肝复康低、中、高剂量组：分别加含体积分数0．1低、中、高剂量药物血清＋60ug／L血小板衍生生长因子的DMEM；各组均培养24h。主要观察指标：反转录-聚合酶链反应检测不同浓度肝复康药物血清干预后Ⅰ、Ⅲ型胶原、a-平滑肌肌动蛋白和金属蛋白酶组织抑制因子1mRNA的表达。结果：空白对照组肝星状细胞T6细胞各指标表达呈相对低水平，而模型对照组表达明显升高（P〈0．01）；肝复康各剂量组则均具有能明显抑制这种升高的作用（P〈0．01），其中以中剂量组干预效果最为明显。结论：中药肝复康对肝纤维化具有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原、a-平滑肌肌动蛋白及金属蛋白酶组织抑制因子1mRNA的转录，从而减少细胞外基质的形成，以达到抗纤维化的作用。     

基于转录组学研究岩藻黄素在扰动剪切应力对EPCs炎性及增殖影响

目的 在扰动剪切应力（Oscillatory shear stress, OSS, ±4 dynes/cm2, 1 Hz）作用下内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）转录组学数据生物信息学分析的基础上,探讨岩藻黄素（Fucoxanthin, FUCO）对OSS作用下的EPCs炎性、增殖以及细胞周期等生物活性改变的影响作用。方法 采用Flexcell flow STR-4000流体系统模拟体内扰动流剪切应力环境;利用Illumina高通量测序平台对相应处理的EPCs进行转录组测序分析,并对筛选到的差异蛋白编码基因进行功能以及通路分析;利用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）验证相应生物信息学数据;Western blot（WB）检测筛选基因-前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）蛋白表达;采用EdU和PI染色分别进行EPCs增殖和周期检测。结果 与静止对照组相比,共计差异表达基因1066个,涉及细胞增殖和死亡、感染性疾病等信号转导通路;GO功能分析显示,该类基因功能主要影响的过程有细胞及细胞组分、细胞进程、细胞器及生物进程等生物活动;根据P值<0.05且Fold change（FC）>2的条件,筛选显著差异基因数17个,并经RT-qPCR以及WB验证,显示PTGS2 mRNA差异表达最为显著（P<0.001）,PTGS2蛋白表达差异明显（P<0.05）;进一步的结果显示,与OSS组EPCs相比,FUCO处理的OSS组EPCs中PTGS2 mRNA表达显著降低（P<0.001）,其蛋白表达被抑制（P<0.05）,并且FUCO处理过的OSS组EPCs增殖活性以及DNA合成能力增强。结论 结合转录组数据基础,提示FUCO能够显著降低OSS引发的EPCs炎症反应,尤其明显抑制炎性因子PTGS2表达;促进EPCs细胞增殖和 DNA合成,这为FUCO临床干预EPCs进而完善心血管疾病干细胞治疗提供理论依据。     

脂蛋白脂酶基因HindⅢ多态性与体质量指数及胰岛素抵抗关系的研究

目的探讨脂蛋白脂酶基因变化与2型糖尿病胰岛素抵抗的关系。方法采用聚合酶链式反应法对122名大连籍2型糖尿病病人和56名同期非糖尿病体检者,脂蛋白脂酶基因第8号内含子H indⅢ酶切点进行多态性分析,同时以放免法测定以上两组人群空腹胰岛素及血糖水平。结果两组基因频率无显著差异,但是H+H+组体质量指数、胰岛素抵抗指数显著高于非H+H+组。结论脂蛋白脂酶基因H indⅢ酶切点多态性与2型糖尿病胰岛素抵抗关联。     

肝复康对PDGF介导的肝星状细胞信号转导的分子机制

目的：通过观察中药肝复康含药血清对肝星状细胞（HSC-T6）细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA基因表达的影响。探讨其抗纤维化的作用机制。方法: 常规方法制备肝复康含药血清，并用不同浓度肝复康含药血清干预HSC-T6细胞株，以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察分析Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达的变化。以Western blotting检测ERK蛋白在不同干预情况下的表达。结果: 经肝复康含药血清处理，可下调HSC-T6细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达以及ERK蛋白表达水平，不同浓度含药血清作用强度也有所不同。结论: 中药肝复康对肝纤维化具有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过非特异性干扰PDGF功能，抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA的转录，以达到抗纤维化的作用。     

青心酮防治动脉粥样硬化与TLR4信号转导途径的关系

目的 观察青心酮对载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉粥样硬化病变的影响及其与平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号转导途径的关系.方法 取小鼠胸主动脉,进行平滑肌细胞、内皮细胞的原代培养,巨噬细胞RAW264.7细胞株传代培养.实验分4组,即空白对照组(正常细胞培养,加入等数量的培养基,不加入任何药物),脂多糖组(LPS组)(加入等数量的培养基3 h,再加入LPS10 ng·mL-1刺激8 h),DHAP组(先加入溶有DHAP 1×10-7mol·L-1的培养基培养3 h,再加入LPS 10 ng·mL-1刺激8 h),辛伐他汀对照组(先加入溶有辛伐他汀5×10-7mol·L-1的培养基培养3 h,再加入LPS 10 ng·mL-1刺激8 h).收集各组细胞蛋白,应用Western-blot检测TLR4蛋白含量.收集上清液,用ELISA法检测TNF-α.取8周龄雄性ApoE(-/-)小鼠20只,随机分成两组,每组10只,模型对照组建立小鼠AS模型,青心酮治疗组经胃管灌注青心酮10 mg·kg-1·d-1.所有实验小鼠均饲以"西方类型膳食"饲料喂养12周.剪取主动脉根部行石蜡切片及HE染色,观察主动脉粥样硬化的病变情况.结果 青心酮组血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4蛋白含量均明显低于未处理组(P<0.01),但高于空白对照组;与辛伐他汀组比较无显著性差异;青心酮组TNF-α含量明显低于未处理组(P<0.01),但高于空白对照组;与辛伐他汀组比较,具有显著性差异(P<0.01);青心酮组AS病灶形成减少.结论 青心酮能够在一定程度上减少AS病灶的形成,可能是通过TLR4信号转导途径发挥作用的.     

脂蛋白脂酶基因PvuⅡ酶切位点多态性与胰岛素抵抗关系的研究

目的旨在探讨脂蛋白脂酶基因第6内含子PvuⅡ酶切位点多态性与胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生之间是否有关联。方法随机选取163例2型糖尿病患者作为病例组，106例正常人作为正常对照组，对第6号内含子PvuⅡI酶切位点进行多态性分析。结果病例组中P＋P＋组高密度脂蛋白胆固醇水平明显低于P-P-组，而血清三酰甘油、胰岛素抵抗指数指标水平高于P-P-组。结论PvuⅡ酶切位点多态性与2型糖尿病中胰岛素抵抗有关。     

青心酮对载脂蛋白E缺陷小鼠主动脉粥样硬化形成及斑块中主要细胞的TLR4表达的影响

目的观察青心酮对小鼠动脉粥样硬化（AS）斑块中平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞Toll样受体4表达（Toll-like receptor 4,TLR4）的影响,及对载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉粥样硬化病变的影响。方法取小鼠胸主动脉,进行平滑肌细胞、内皮细胞的原代培养,RAW264.7（小鼠巨噬细胞）细胞株传代培养。实验分4组：空白对照组,脂多糖（LPS）组,青心酮组,辛伐他汀组。收集各组细胞总mRNA及蛋白,应用RT-PCR及Western-blot方法检测TLR4 mRNA及蛋白。取30只8周龄雄性ApoE（-/-）小鼠,随机分成3组：模型组（n=10）,每天生理盐水灌胃;青心酮治疗组（n=10）经胃管灌注青心酮10mg·kg^-1·d^-1,辛伐他汀治疗组（n=10）经胃管灌注辛伐他汀10mg·kg^-1·d^-1。所有实验小鼠均饲以＂西方类型膳食＂饲料12周。剪取主动脉根部切片及HE染色观察主动脉粥样硬化病变情况。结果1×10^-7mol·L^-1青心酮组血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白含量明显低于未处理组（P〈0.01）;与辛伐他汀组比较无显著性差异;青心酮组AS病灶形成减少。结论青心酮可下调LPS活化的小鼠平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4mRNA和蛋白的表达,在一定程度上能减少AS病灶的形成,可能通过TLR4途径发挥其作用。