一个中国Usher综合征2型家系中USH2A基因的2个新的致病突变

目的为了扩大USH2A突变的范围并进一步揭示USH2A基因在2型Usher综合征（Usher syndrome type 2, USH2）中的作用,对中国的USH2患者进行了USH2A基因突变筛选。方法从收集到的中国USH2患者及其家属的外周血中提取基因组DNA,设计特异性引物扩增USH2A基因编码区（外显子2-72）并使用Sanger测序研究等位基因并与NCBI数据库中的标准序列进行比对。使用PolyPhen-2等预测软件对筛选出来的突变的致病性进行预测。结果在1例患者中检测到2个之前未报道过的致病的杂合突变c.230dupA(Phe78Valfs*30)和c.4085C＞T(p.Pro1362Leu)。结论通过全外显子测序鉴定了可能导致USH2的2个新的杂合USH2A基因致病突变。这一结果扩大了已知的USH2A基因致病突变的范围。     

先天性特发性眼球震颤家系在FRMD7基因上的突变研究

目的　对我国一个先天性特发性眼球震颤（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｎｙｓｔａｇｍｕｓ,ＣＩＮ）家系进行基因突变筛查。方法　在获取知情同意后,对该家系成员进行病史采集及眼科检查。采集该ＣＩＮ家系成员及２００名正常对照者的外周静脉血各５ｍＬ,并提取基因组ＤＮＡ。对ＦＲＭＤ７基因进行引物的设计与合成,使用聚合酶链式反应技术对ＦＲＭＤ７基因的所有编码区序列进行扩增,扩增产物直接测序,寻找突变位点。结果　在该ＣＩＮ家系发现ＦＲＭＤ７基因上ｃ．１００３Ｃ＞Ｔ突变,该突变为无义突变（ｐ．Ｒ３３５Ｘ）。家系中５例患者均为男性且为该突变的纯合子,３位女性携带者为该突变的杂合子,其余成员和２００名正常对照者均未发现此突变。结论　该ＣＩＮ家系致病突变为ＦＲＭＤ７基因上ｃ．１００３Ｃ＞Ｔｐ．Ｒ３３５Ｘ突变。     

EBI3与Sedlin蛋白的相互作用

目的初步确定EBI3蛋白与Sedlin之间相互作用的区域。方法构建缺失突变体，利用酵母双杂交系统进行测试。结果正确构建了4个EBI3基因的突变体，将突变体与Sedlin基因共转化酵母细胞后，β-半乳糖苷酶测试表明酵母克隆均为阳性。结论EBI3蛋白的氨基酸54-97区域和166～229区域均可与Sedlin结合。     

酵母双杂交技术筛选胞内氯离子通道蛋白1结合蛋白

目的应用酵母双杂交技术研究胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）的结合蛋白,以进一步了解其功能。方法首先将CLIC1的全长cDNA连接到pGBKT7载体中,重组质粒pGBKT7-CLIC1转化入酵母菌株AH109,再将人Hela细胞的cDNA文库转化AH109细胞,用α-gal检测阳性克隆。所获得阳性克隆测序后进行BLAST检索。结果用酵母双杂交方法筛选到了16个阳性克隆,其中有4个是已知蛋白的基因。结论利用酵母双杂交系统筛选到了数个结合蛋白。     

Nectin-3序列初步分析及其表达定位

目的　初步分析人的细胞黏附蛋白Nectin-3（nectin cell adhesion molecule 3）的序列并研究其亚细胞定位，观察小鼠Nectin-3眼部表达情况。方法　分析Nectin-3核苷酸序列并对其编码的3个同源异构体进行氨基酸序列比对分析。构建带eGFP荧光标签的Nectin-3 3个同源异构体的重组质粒，转染到HEK293T细胞内，Western印迹法实验检测其蛋白表达。分别转染至HeLa细胞内，细胞免疫荧光检测其亚细胞定位。免疫组织化学实验检测Nectin-3在新生小鼠眼球组织的表达情况。结果　Nectin-3在目前数据库中共有的转录本有3个，分别编码3个同源异构体iso1（isoform1）、iso2（isoform2）和iso3（isoform3）。序列分析显示它们的N端和/或C端氨基酸序列不同，编码iso3的基因的启动子与iso1和iso2的启动子不同。成功构建Nectin-3的3个同源异构体的荧光融合蛋白表达质粒，Western印迹法显示iso1和iso2的融合蛋白均出现比预测的分子量更小的条带，iso3的融合蛋白与预测的分子量大小基本一致。免疫荧光实验显示iso3表达主要在细胞质中，iso1与iso2表达在细胞核和细胞质均可见；免疫组织化学显示Nectin-3在晶状体上皮细胞和纤维细胞、视网膜上皮细胞和睫状体色素和非色素上皮细胞之间区域均有表达。结论　Nectin-3在新生小鼠眼球组织表达，iso1与iso2可能被酶切割，3个同源异构体的亚细胞定位存在差异，这些实验数据将为后续研究Nectin-3的功能奠定实验基础。