经治低水平病毒血症慢性乙型肝炎患者耐药突变的基因型特征

目的 分析经治低水平病毒血症(LLV)慢性乙型肝炎(CHB)患者反转录酶(RT)区耐药突变的基因型特征。方法 回顾性研究2007年9月-2019年8月在解放军总医院第五医学中心就诊的经治LLV CHB患者2096例,提取其血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA,并采用巢式PCR扩增HBV RT片段,长度为1225 bp(nt54-nt1278),包含HBV RT基因(nt130-nt1161)及S基因(nt155-nt835)。对PCR产物进行双向测序,采用MEGA4软件对RT/S基因序列进行分子进化树分析,以肝炎病毒数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.Cgi)的标准序列为参照进行HBV基因分型。结果 2096例CHB患者中男1727例,女369例,年龄(45.6±12.0)岁,HBV DNA为(2.5±0.5)log10 IU/ml。拉米夫定耐药相关突变1216例,占58.0%,以M204I/V、L180M+M204V为主要形式;阿德福韦耐药相关突变444例,占21.2%,以A181V、N36T为主要形式...     

桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布研究

目的:研究桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布特点,为本地区乙型肝炎的防治提供依据.方法:采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,采用Mega 5.0构建系统树进行基因亚型分型.结果:从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型,序列分型B2 104例,占86.7％;B4 1例,占0.8％;B5 1例,占0.8％,其中14例未分出亚型,占11.7％.结论:桂林地区HBV B基因亚型主要以B2为主,其次为B4、B5,未发现B1、B3、B6亚型.     

隐匿性HBV感染相关S基因突变对HBsAg检测的影响及其机制

目的 探讨隐匿性HBV感染(OBI)相关S基因突变对多种抗-HBs及HBsAg临床检测试剂的反应性.方法 9种代表性S基因突变株(M1-M9,其中M1-M5为本课题组首次报道)分离自1例OBI患者和3例OBI献血人员血清.分别采用野生型及突变型S基因重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞,分析9种突变株HBsAg表达及其突变蛋白对抗体和检测试剂反应的影响.结果 采用HBsAg罗氏诊断试剂Elecsys定量检测9种突变株胞内HBsAg水平,均较野生株的水平明显下降;相同样品用抗-His抗体检测显示仅M1、M6和M7的HBsAg-His融合蛋白表达水平与野生株比较明显降低.6种抗-HBs与各突变HBsAg的反应性结果(S/CO值)显示,与野生株相比,多数突变株与6种抗-HBs的反应性明显降低,M1、M4、M7和M9产生的HBsAg与抗体4及M9产生的HBsAg与抗体6反应性最差(S/CO＜1).6种商品化HBsAg临床试剂检测结果显示,多数突变株与6种HBsAg试剂反应性较野生株明显降低(P＜0.05),ELISA试剂D、E和F漏检率分别为11.1％、22.2％和55.6％.结论 本实验涉及的突变HBsAg与抗-HBs的结合力降低是引起OBI表现的主要原因之一.当前临床常用HBsAg检测试剂对突变HBsAg的检测能力存在明显不足,亟待提高.     

HBV反转录酶区rtA181S变异与阿德福韦酯耐药相关性研究

目的：分析HBV反转录酶（RT）区rtA181S变异与阿德福韦酯（ADV）耐药的相关性。方法应用直接测序法筛选分析大样本慢性HBV感染者rtA181S变异的检出频率,并对1例接受ADV单药治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清中HBV RT区基因进行克隆测序,分析相关变异形式。用XhoⅠ和SphⅠ双酶切pGEM-Teasy RT及pTriEx-HBV（C）载体后再连接,构建1.1倍HBV野生株和耐药株的重组质粒,转染人肝癌细胞系HepG2细胞,5 h后分别加入不同浓度的 ADV（0、0.033、0.100、0.330、1.000、3.300μmol/L）。隔天换药,4 d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用下细胞培养上清中的HBV DNA载量,并分析其表型耐药特点。结果9830例慢性HBV感染者的12000个血清样本中,有46例样本检出rtA181S变异（单独或与其他耐药变异联合出现）,在653例中检出经典的rtN236T/A181V变异。其中随访的1例在接受ADV治疗19个月后出现了病毒学和生化学突破,直接测序检出rtA181S＋N236T变异,克隆测序分析显示在24个克隆中11个（45.83%）为野生型,6个（25.00%）为rtN236T变异型,5个（20.83%）为rtA181S变异型,1个（4.16%）为rtA181V变异型,1个（4.16%）为rtA181S＋N236T变异型。在体外实验中,rtN236T、rtA181S和rtA181S＋N236T变异株的相对复制力分别是野生株的91.35%、29.90%和68.53%。表型耐药分析显示rtN236T、rtA181S和rtA181S＋N236T变异株对ADV的灵敏性分别为野生株的1/4.41、1/3.05和1/5.43。结论 rtA181S是一种ADV耐药相关变异,可单独或联合其他变异引起患者耐药。但与经典ADV耐药变异相比,rtA181S变异引起的ADV耐药相对较弱,临床检出率较低。     

多种肝脏疾病中隐匿性HBV感染检出率及其S基因MHR免疫逃逸相关突变特点分析

目的　分析多种肝脏疾病中隐匿性HBV感染（occult HBV infection, OBI）检出率,并探讨OBI患者HBV S基因主要亲水区（major hydrophilic region, MHR）免疫逃逸相关突变特点。方法　回顾性分析2005年1月—2017年12月就诊于中国人民解放军总医院第五医学中心的91 037例HBV感染住院患者临床资料,筛选出OBI患者并扩增其HBV S基因序列,分析其HBV S基因MHR免疫逃逸相关突变特点。结果　91 037例住院患者中OBI总检出率为0.53%（487/91 037）,急性乙型肝炎患者中OBI检出率最高（9.26%,130/1404）,肝硬化患者中OBI检出率最低（0.26%,78/29 921）。62例OBI患者组与124例非OBI患者组相比,OBI患者组MHR免疫逃逸相关突变总体检出率显著高于非OBI患者组（59.68% vs. 35.48%;P＜0.05）;OBI患者组MHR多个免疫逃逸相关突变的联合检出率显著高于非OBI患者组（43.55% vs. 22.58%;P＜0.05）;其中,sT118K、sK122R和sV168A 3种单点突变的检出率显著高于非OBI患者组。结论　本研究显示临床HBV感染患者中有较高的OBI检出率,而且不同肝脏疾病中OBI检出率不同。此外,HBV S基因MHR的免疫逃逸相关突变与临床实践中OBI的发生密切相关。     

60℃加热1小时灭活病毒方法对常规临床检测指标的影响研究

目的基于60℃加热1 h可有效灭活埃博拉病毒的观点,探讨用该条件加热处理对常规临床检测指标的影响。方法对40例受检者用枸橼酸钠抗凝管和EDTA-K2抗凝管分别采集静脉血,标本分为2份,检测未进行加热灭活处理(灭活前)和进行了加热灭活处理(灭活后)样本的生物化学、免疫、凝血和血常规指标,比较热灭活前后各指标的差异。结果与灭活前相比,灭活后样本的生物化学和免疫项目中总蛋白、总胆红素、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、钠、钾、氯、C-反应蛋白、尿素氮、葡萄糖、HBs Ab水平差异无统计学意义(P均0.05);白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶有较显著降低,但下降幅度不到80%且灭活前、后数据存在相关性(r0.80,P0.01),用回归方程校正后检测数据仍具有参考价值;碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转移酶、胆碱酯酶和肌酸激酶的测定值下降非常明显(P均0.01),且灭活前后2组数据无显著相关性。凝血检测项目中,D-二聚体在2组间的差异无统计学意义(P0.05);其余项目均受到热灭活严重影响。血常规项目中,血红蛋白、白细胞和血小板计数在2组间的差异无统计学意义(P0.05),但样本须要事先稀释。结论 60℃加热1 h灭活处理对部分生物化学、免疫和血常规项目无明显影响,部分项目检测值明显降低,但其中有6项指标经校正后仍具参考价值。     

新型血清学标志物在不同类型乙型肝炎病毒感染中的检出特征分析

目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)新型血清学标志物HBVRNA、HBV核心抗原相关抗原(HBcrAg)、HBV核心抗体(anti-HBc)及肝组织HBV总DNA(tDNA)、共价闭合环状DNA(cccDNA)在不同类型HBV感染中的检出特点。方法 纳入2017年1月-2019年12月在解放军总医院第五医学中心住院并接受肝组织活检的227例不同疾病类型的HBV感染患者,回顾性分析其临床资料,检测其血清HBVRNA、HBcrAg、anti-HBc定量及肝组织HBVtDNA、cccDNA水平,比较分析各指标的特征以及抗病毒治疗对其的影响。结果 在16例急性乙型肝炎(AHB)患者中,HBV RNA检出率为25.0%(4/16),HBcrAg检出率为93.8%(15/16),肝组织HBV tDNA及cccDNA检出率分别为87.5%(14/16)及81.3%(13/16)。在184例慢性乙型肝炎(CHB)患者中,34例接受核苷(酸)类似物(NAs)治疗,其HBVRNA和HBcrAg定量均明显低于未治疗组,anti-HBc定量明显高于未治疗组(P<0.05)。在18例肝硬化(LC)患者中,9例...     

多种肝脏疾病中隐匿性HBV感染检出率及其S基因MHR免疫逃逸相关突变特点分析

目的分析多种肝脏疾病中隐匿性HBV感染(occult HBV infection,OBI)检出率,并探讨OBI患者HBV S基因主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)免疫逃逸相关突变特点。方法回顾性分析2005年1月—2017年12月就诊于中国人民解放军总医院第五医学中心的91037例HBV感染住院患者临床资料,筛选出OBI患者并扩增其HBV S基因序列,分析其HBV S基因MHR免疫逃逸相关突变特点。结果91037例住院患者中OBI总检出率为0.53%(487/91037),急性乙型肝炎患者中OBI检出率最高(9.26%,130/1404),肝硬化患者中OBI检出率最低(0.26%,78/29921)。62例OBI患者组与124例非OBI患者组相比,OBI患者组MHR免疫逃逸相关突变总体检出率显著高于非OBI患者组(59.68%vs.35.48%;P<0.05);OBI患者组MHR多个免疫逃逸相关突变的联合检出率显著高于非OBI患者组(43.55%vs.22.58%;P<0.05);其中,sT118K、sK122R和sV168A 3种单点突变的检出率显著高于非OBI患者组。结论本研究显示临床HBV感染患者中有较高的OBI检出率,而且不同肝脏疾病中OBI检出率不同。此外,HBV S基因MHR的免疫逃逸相关突变与临床实践中OBI的发生密切相关。