不同厚度神经球冰冻切片免疫荧光细胞化学染色结果的比较

目的探索适合免疫荧光细胞化学染色的神经球最佳冰冻切片厚度。方法选取悬浮培养10～12 d的神经球,制作厚度分别为4、7、10μm的冰冻切片。采用免疫荧光细胞化学染色比较神经球神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达和定位。结果培养10～12 d的神经球直径为200～250μm,状态良好,折光性强,呈圆球状,周边有毛刺。4μm的神经球冰冻切片制作较难,容易卷片,但细胞层次清楚,染色均匀,密疏适宜,可较清楚计数细胞。成像清楚。胞核清晰,可见较多nestin染色阳性的完整胞质包绕4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色阳性的胞核,能观察更多的细胞间细节。7μm切片较4μm切片制作容易,切片较平整,细胞层次不如4μm切片清楚,染色较均匀。所含细胞数较4μm多,可粗略计算细胞数。荧光拍照不能完全对焦,可见部分完整细胞形态。10μm的冰冻切片制作相对容易,切片平整,但细胞层次不清楚,堆叠严重,成像不清楚,难以看到完整细胞形态。结论 4μm厚度的神经球冰冻切片较适合进行免疫荧光细胞化学染色和分析。     

粒细胞集落刺激因子对大鼠体内外源性人神经干细胞存活分化的影响

目的 观察缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)新生大鼠应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)对移植的人神经干细胞(human neural stem cells, hNSCs)体内存活及分化成少突胶质细胞的影响。方法 新生1周的Wistar大鼠HIBD模型后分成两组:NSCs移植组(A组, n=24)和NSCs移植+G-CSF治疗组(B组, n=24), 其中B组建模后1 h即开始皮下注射G-CSF, 每天1次, 移植前后连续5 d注射G-CSF。两组均于建模后第2天经脑室移植hNSCs。移植后3 d用TUNEL法检测植入细胞凋亡情况, 并于移植后1周、2周分别用免疫荧光法检测植入细胞在大鼠脑内的存活及向少突胶质细胞方向分化情况。结果 移植后3 d, A组大脑皮层见大量的植入细胞处于凋亡状态, 而B组的植入细胞凋亡明显减少(t=68.36, P<0.01)。移植后1周及2周, 可见植入细胞分布以额叶皮层和海马多见, 纹状体亦有少许植入细胞分布, A组的植入细胞数少于B组(t=14.07和2.5, P<0.05)。而移植后1周及2周, hNSCs几乎不能分化成少突胶质细胞。结论 G-CSF能减少植入细胞的凋亡, 提高植入细胞的存活率, 但对植入细胞向少突胶质细胞方向的分化无影响。     

人神经前体细胞移植治疗儿童广泛性发育障碍初探

目的：观察人神经前体细胞（hNPCs）移植治疗儿童广泛性发育障碍的安全性及疗效。方法：对22例广泛性发育障碍患儿进行研究,其中孤独症9例,Rett综合征13例,经颅骨钻孔侧脑室穿刺注射hNPCs治疗。分别于手术前、术后1个月、术后6个月、术后1年采用孤独症行为评定量表（ABC）对移植患儿进行评估。结果：治疗及随访过程中无严重不良事件发生。移植后22例患儿中,1例失访,17例患儿临床症状出现不同程度的改善,其中孤独症患儿8例,Rett综合征患儿9例。孤独症患儿行ABC量表评估后发现,术后6个月交往因子得分,以及术后1年ABC总分、交往及语言因子得分均低于术前,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：临床应用hNPCs移植治疗儿童广泛性发育障碍是安全、可行的,并具有一定疗效,有必要扩大观察病例数进一步研究。     

超顺磁性氧化铁标记神经干细胞及对其生物学特性的影响

背景:细胞标记与核磁共振联合,可无创性活体标记移植的神经干细胞存在部位、存在方式及其一些生物学特性.目的:观察超顺磁性氧化铁体外标记人神经干细胞的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-12/2007-06在解放军海军总医院儿科实验室完成.材料:流产人胚胎由解放军海军总医院提供.超顺磁性氧化铁,Lot number97060601,为Advanced magnetics,inc.American 产品.方法:取人胚胎脑海马组织,机械法分离单细胞悬液,加入含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的神经干细胞培养基体外培养.取11.2 g/L.超顺磁性氧化铁,用神经干细胞培养基稀释成28 mg/L.后,加入1.0 mg/L多聚赖氨酸8μL混匀,制成超顺磁性氧化铁一多聚赖氨酸复合物的标记培养基.取增殖活跃的神经干细胞球,机械吹散制成浓度为1×109 L-1的单细胞悬液,加入等体积的含超顺磁性氧化铁的无血清培养液.1周后撤除各种细胞因子,添加体积分数为5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化24 h.主要观察指标:普鲁士蓝染色鉴定标记阳性率,免疫荧光染色检测分化细胞胶质纤维酸性蛋白和神经丝的表达. 结果:超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞球颜色微黄,与末标记细胞比较,其克降形成的速度并没有减慢.经超顺磁性氧化铁标记20 h后,神经干细胞胞浆中含有蓝色铁颗粒,阳性率达90%.诱导后超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞胶质纤维酸性蛋白、神经丝均呈阳性表达.结论:在体外超顺磁性氧化铁能够高效标记神经干细胞,且标记后不影响其生物学特性,仍可以正常扩增和定向分化为神经元、星形胶质细胞.     

自体骨髓单个核细胞移植治疗重度精神发育迟滞儿童临床观察

目的观察自体骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell,BM MNC)移植治疗重度精神发育迟滞(mental retardation,MR)儿童的临床疗效。方法海军总医院儿科自2011年1月—2012年3月收治的重度MR患儿40例(年龄2~14岁),骨髓动员后进行BM MNC分选,分别进行右侧颈动脉穿刺1次及腰椎穿刺3次行BM MNC移植。每次移植的BM MNC细胞数为1×106 /kg。每例患儿对其进行术前6个月及术后6个月自身对照观察,采用家长随访量表,评估2个相同长度时间段内患儿智力、运动的发育状态。同时对移植术后1、3、6个月及1年患儿的发育情况进行追踪随访分析。结果40例中3例失访,余37例完成评估随访。其中,术后有明显进步19例,有效率为513%;患儿在术后3 d至1个月逐渐出现不同程度的变化,持续至术后6个月后无再进步病例。随访量表进步值术前6个月为（469±433）分,术后6个月为(1604±1254)分,进步幅度术后较术前明显增加,差异有统计学意义(P<0．01)。结论自体BM MNC移植安全可靠,能在短时间内改善重度MR患儿智力发育水平,移植及手术不良事件极其轻微。     

神经干细胞治疗甲基丙二酸血症继发脑损伤4例临床观察

目的观察神经干细胞治疗甲基丙二酸血症继发脑损伤儿童的临床疗效。方法2008年4月—2010年10月在我院治疗的甲基丙二酸血症继发脑损伤儿童4例,所有患儿均在磁共振头皮定位下行侧脑室穿刺神经干细胞移植。移植后1个月对患儿综合评估,并随访至移植后6个月,对患儿行Gesell发育量表评估。结果4例中,3例在移植后1个月内出现大运动、精细动作、视听反应及智力反应等方面的进步;跟踪随访至移植后6个月,3例均持续出现不同程度进步。细胞治疗均未出现不可逆不良事件。结论神经干细胞治疗安全可靠,能在短时间改善甲基丙二酸血症继发脑损伤患儿的运动和智力表现,并能持续至移植后6个月。在维持基础对因治疗的前提下,为甲基丙二酸血症继发脑损伤患儿提供了新的治疗方法,但远期疗效有待进一步随访观察。     

改良型脑性瘫痪大鼠模型的建立与评估

目的 探讨孕后期脂多糖混合溶液腹腔注射及序贯缺氧缺血对幼鼠出生28 d时体质量、行为学的影响及脑组织病理学变化,评定新型脑性瘫痪动物模型构建的优势.方法 孕鼠(首次怀孕10 d)15只,随机取12只为实验组,孕16d时予脂多糖腹腔注射及缺氧处理,隔日1次,直至分娩,新生大鼠与母鼠为同一组,新生大鼠出生7d结扎双侧颈总动脉;对照组孕鼠于相应日期予9 g/L盐水腹腔注射至分娩,分娩后新生大鼠与母鼠为同一组.2组新生大鼠监测出生28 d生长发育情况,包括体质量、睁眼时间、抓力实验、旋杆实验,并行脑组织病理学检测.结果 实验组与对照组新生大鼠出生体质量分别为(5.6±0.9)g和(6.2±0.8)g,睁眼时间分别为左眼(16.9±2.0)d和(13.0±2.0)d,右眼(23.1±2.6)d和(13.7±1.7)d;2组比较差异有统计学意义(P均＜0.05)抓力测试过程中得分分别为(2.7±0.8)分和(1.5±0.4)分.神经功能缺损评分分别为(4.9±2.5)分和(1.2±1.0)分,2组相比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).实验组和对照组旋杆实验得分分别为(1.9±0.6)分和(1.9±0.4)分,2组比较差异无统计学意义(P=0.871).实验组脑组织病理切片HE染色显示神经元排列紊乱,丢失,白质变薄,脑实质有炎性细胞浸润,并可见到明显细胞海绵状变性;对照组灰质层清晰,神经元规则排列,灰白质界限清楚.结论 孕后期予脂多糖腹腔注射及序贯缺氧缺血能构建稳定的脑性瘫痪模型.     

脂肪干细胞生物活性分泌物防治早产儿脑白质损伤的安全性及早期疗效北大核心CSCD

目的探索脂肪干细胞生物活性分泌物（ASCBS）鞘内注射防治早产儿脑白质损伤（WMI）的安全性和疗效。方法按统一标准在多个医疗中心分3个胎龄组募集63例WMI早产儿,A组：胎龄24～28^＋6周,21例;B组：胎龄29～32^＋6周,20例;C组：胎龄33～36^＋6周,22例。各胎龄组以抛硬币的方法随机分为治疗组及对照组,治疗组连续3 d每天1次腰椎穿刺并鞘内注射ASCBS。于矫正胎龄足月进行新生儿行为神经测定（NBNA）,于矫正月龄6个月通过贝利婴幼儿发展量表（BSID）、Peabody运动发育量表第2版（PDMS-2）进行神经发育评估,比较2组间早产儿存活率、NBNA评分、智力发育指数（MDI）、精神运动发育指数（PDI）及PDMS-2发育商。结果63例中包括治疗组31例,对照组32例,所有病例中只有治疗组1例失访。治疗组未发现治疗相关不良反应,所有胎龄组中治疗组及对照组存活率及早产并发症发生率比较差异均无统计学意义（均P〉0.05）。治疗A组的纠正6月龄的粗大运动发育商及总运动发育商高于对照A组,差异均有统计学意义（粗大运动发育商：治疗A组98.330±6.282、对照A组90.330±3.777,P＝0.040;总运动发育商：治疗A组97.330±4.803、对照A组91.000±4.472,P＝0.023）,其余结果未发现组间差异。结论ASCBS治疗早产儿WMI具有较好安全性,并能促进24～28周出生胎龄早产儿的运动发育。