人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布

目的:新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法.将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化.方法:实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成.①对象:神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定.清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×1011L-1,培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪.两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3 d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水.③实验评估:取未经PKH标记的细胞球, 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况.分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况.结果:在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%～90%.①神经干细胞的鉴定及分化:80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞.②神经干细胞植入后存活及分布情况:植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布.植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似.植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少.结论:在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广.     

不同厚度神经球冰冻切片免疫荧光细胞化学染色结果的比较

目的探索适合免疫荧光细胞化学染色的神经球最佳冰冻切片厚度。方法选取悬浮培养10～12 d的神经球,制作厚度分别为4、7、10μm的冰冻切片。采用免疫荧光细胞化学染色比较神经球神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达和定位。结果培养10～12 d的神经球直径为200～250μm,状态良好,折光性强,呈圆球状,周边有毛刺。4μm的神经球冰冻切片制作较难,容易卷片,但细胞层次清楚,染色均匀,密疏适宜,可较清楚计数细胞。成像清楚。胞核清晰,可见较多nestin染色阳性的完整胞质包绕4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色阳性的胞核,能观察更多的细胞间细节。7μm切片较4μm切片制作容易,切片较平整,细胞层次不如4μm切片清楚,染色较均匀。所含细胞数较4μm多,可粗略计算细胞数。荧光拍照不能完全对焦,可见部分完整细胞形态。10μm的冰冻切片制作相对容易,切片平整,但细胞层次不清楚,堆叠严重,成像不清楚,难以看到完整细胞形态。结论 4μm厚度的神经球冰冻切片较适合进行免疫荧光细胞化学染色和分析。     

慢性难治性原发性免疫性血小板减少症治疗进展

原发性免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP)原称特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP),是一种自身免疫性疾病,是由于机体免疫系统功能紊乱引起血小板破坏增多致其数目减少引起的出血性疾病,临床表现为皮肤黏膜瘀点、瘀斑,尿血,严重者可引起内脏和颅内出血危及生命,骨髓象表现为巨核细胞发育、成熟障碍。儿童急性ITP大多预后良好,75%~82%急性ITP 6个月内可获得缓解,持续6个月以上的ITP中超过1/4在     

脐血移植治疗37例儿童恶性血液病的临床研究-单中心经验

目的 探讨脐血造血干细胞移植（UCBT）治疗儿童恶性血液病的疗效。方法 回顾性分析接受UCBT 的37 例恶性血液病患儿的临床资料，包括急性淋巴细胞性白血病14 例，急性髓细胞性白血病9 例，幼年粒单细胞白血病5 例，慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征各3 例，急性混合型白血病2 例，淋巴肉瘤性白血病1 例。其中34 例非血缘相关，3 例血缘相关。HLA 配型6/6 相合5 例，5/6 相合12 例，4/6 相合11 例，3/6 相合9 例。移植中位年龄5.7 岁，中位体重20 kg。结果 中性粒细胞和血小板植入中位天数分别是12 d 和25 d，植入率分别为95% 和78%。中性粒细胞植入率与CD34+ 细胞数呈正相关（P=0.011）。血小板植入率与CD34+ 细胞数和有核细胞数均有关（分别P=0.001、0.014）。急性移植物抗宿主病（GVHD）的发生率为49%，慢性GVHD 为11%。随访中位时间54 个月，5 年移植相关病死率、总生存率和无病生存率分别为27%、57%和41%。结论 脐血移植是快速获得的造血干细胞来源之一，为恶性疾病患儿争取了治疗时间。     

粒细胞集落刺激因子对大鼠体内外源性人神经干细胞存活分化的影响

目的 观察缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)新生大鼠应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)对移植的人神经干细胞(human neural stem cells, hNSCs)体内存活及分化成少突胶质细胞的影响。方法 新生1周的Wistar大鼠HIBD模型后分成两组:NSCs移植组(A组, n=24)和NSCs移植+G-CSF治疗组(B组, n=24), 其中B组建模后1 h即开始皮下注射G-CSF, 每天1次, 移植前后连续5 d注射G-CSF。两组均于建模后第2天经脑室移植hNSCs。移植后3 d用TUNEL法检测植入细胞凋亡情况, 并于移植后1周、2周分别用免疫荧光法检测植入细胞在大鼠脑内的存活及向少突胶质细胞方向分化情况。结果 移植后3 d, A组大脑皮层见大量的植入细胞处于凋亡状态, 而B组的植入细胞凋亡明显减少(t=68.36, P<0.01)。移植后1周及2周, 可见植入细胞分布以额叶皮层和海马多见, 纹状体亦有少许植入细胞分布, A组的植入细胞数少于B组(t=14.07和2.5, P<0.05)。而移植后1周及2周, hNSCs几乎不能分化成少突胶质细胞。结论 G-CSF能减少植入细胞的凋亡, 提高植入细胞的存活率, 但对植入细胞向少突胶质细胞方向的分化无影响。     

人神经干细胞异种移植示踪检测分析

目的摸索人胎脑神经干细胞（hNSC）在动物移植研究中理想的示踪检测方法，探讨hNSC移植后的命运，为新生儿缺氧缺血性脑损伤的干细胞治疗提供依据。方法用添加表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子＋白血病抑制因子的N2培养基从流产的人胚胎前脑组织培养出神经干细胞球，通过免疫荧光技术检测神经干细胞巢蛋白（Nestin）抗原标志和细胞分化潜能以鉴定其干细胞属性。取体外培养6d的神经干细胞集落，进行PKH26标记后培养和分化示踪。将培养14 d的神经球移植到缺氧缺血性脑病的新生鼠侧脑室，12只鼠分为PKH26标记示踪组（4只）、免疫反应检测组（4只）和对照组（4只），于移植后第4、7、14天杀鼠取脑，全脑切片，行抗人细胞核抗体（抗-hNuc）和抗人神经丝抗体（Anti-hNF）的特异性免疫反应检测及PKH26的荧光观察。结果体外培养获得典型人胎脑神经干细胞球。PKH26能高效标记神经干细胞，标记的阳性率〉95％，标记分子可伴随干细胞增殖、迁移和分化，但不进入细胞突起，仅位于胞体。Anti-hNuc免疫荧光检测和PKH26示踪结果显示：植入脑室的hNSC，4d即可迁移到嗅球、额叶皮层内侧中央前区、海马、枕叶皮层等部位的颗粒层内，小脑蒲氏细胞层有单层标记细胞排列，中脑区域也有广泛的标记细胞分布，损伤灶区有明显多的移植细胞分布。抗-hNF检测结果显示：在大脑皮层的颗粒层有阳性反应细胞，彼此间有连接发生。结论可用PKH26对体外培养获得的hNSC进行标记示踪。Anti-hNuc可用于检测移植细胞在受体鼠脑内的分布，抗-hNF可用于检测移植细胞的成神经元分化及神经元问发生的连接。hNSC经脑室途径移植缺氧缺血性损伤的新生大鼠脑，可快速迁移到全脑多处远距离部位，并构建神经元连接，损伤灶区对移植细胞有牵引作用。     

自体外周血CD34+细胞移植治疗小儿重症自身免疫性疾病的初步观察

目的探讨自体外周血CD34^＋细胞移植治疗小儿重症自身免疫性疾病的疗效问题。方法3例重症自身免疫性疾病患儿接受自体外周血CD34^＋细胞移植。首先采用环磷酰胺（CTX）＋粒细胞集落刺激因子（G—CSF）方案动员外周血干细胞，通过CliniMACS细胞分选仪分选CD34^＋细胞后冻存。然后选用BEAM＋抗胸腺细胞球蛋白（ATG）或CTX＋马法兰（Mel）＋ATG两种方案预处理，0d回输CD34^＋细胞。观察造血重建、免疫恢复以及症状体征变化情况。结果动员获得了足够单个核细胞，纯化后CD34^＋细胞纯度高。粒细胞植入时间分别为9、13、11d，血小板植入时间分别为14、18和13d。3例原发病缓解。随访14～16个月，皮肌炎皮损消失、四肢肌力恢复正常，类风湿关节炎疾病活动评分（DAS28）由7.3分降至2.4分，系统性红斑狼疮DAI评分由16分降至4分。结论自体外周血CD34^＋细胞移植是常规治疗无效的小儿重症自身免疫性疾病的可选择治疗措施之一。     

造血干细胞移植治疗儿童白血病

1 造血干细胞(HSCT)治疗儿童急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病(ALL)规范化疗后长期无病生存率高达80%,因此,对于第一次完全缓解(CR 1)的AL患儿原则上选择化疗,但以下情况需选择HSCT.     

儿科脐带血造血干细胞移植现状与进展

1988年Gluckman成功进行第一例同胞脐带血造血干细胞移植(UCBT),事隔20年全世界储存脐血250 000份,UD-UCBT近万例,脐带血造血干细胞移植成为造血干细胞移植(HSCT)的主要形式之一.     

人神经干细胞移植治疗脑性瘫痪并重度视觉障碍患儿的疗效

目的 观察人神经干细胞(NSCs)移植治疗脑性瘫痪(CP)并重度视觉障碍患儿的临床疗效,探讨重度视觉障碍患儿可能的治疗方法.方法 11例严重视觉障碍的CP患儿行人NSCs移植.取孕11周正常发育人胚胎前脑细胞,在培养基中进行培养,培养基中添加表皮生长因子20μg/L、碱性成纤维细胞生长因子10μg/L、白血病抑制因子1μg/L,培养至第14天,获取生长旺盛的NSCs小集落.制成细胞悬液,并经前肉穿刺注入患儿右侧侧脑室.术后即进行临床视觉功能的观察,同时第28天进行闪光视觉诱发电位(F-VEP)、功能核磁(fMRI)及眼底复查,术后视觉检查追踪至6个月.结果 移植后7例患儿在术后第6-13天即出现视觉功能改善,表现为临床视物及视物追踪的明显好转.同时伴F-VEP、fMRI的改变.另4例患儿无效.无1例患儿出现病情的倒退及其他不良并发症.结论 人NSCs移植能改善部分CP并重度视觉障碍患儿的视觉功能.实用儿科临床杂志,2009,24(10):771-773