腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶双自杀基因对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察构建的含胞嘧啶脱氨酶／单纯疱疹病毒－1－胸苷激酶（CD／TK）双自杀基因的重组腺病毒对血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。方法：将含CD／TK单、双自杀基因的重组腺病毒感染培养至3－5代的大鼠VSMCs。荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白的数量确定感染效率。用MTT法检测前体药物对各转基因组细胞增殖的抑制作用。结果：单、双自杀基因组腺病毒均可100％感染VSMCs。当感染复数（M．0．I）为10时，双自杀基因组靶细胞的存活率仅10％，明显低于腺病毒（Ad）－TK（43％）和Ad-CD(64%)单基因组（P＜0．05）。当M．O．I≤20时双自杀基因能够对细胞产生最大（90％）杀伤而CD、TK单基因组和单基因共转染组则不能，而且双基因组所需前体药物的浓度（无环鸟苷0．1μg/ml,5－氟胞嘧啶10μg/ml)低于单基因组（无环鸟苷0．5μg/ml，5-氟胞嘧啶50μg/ml）。双基因组的TK或CD基因单独作用时对细胞的抑制作用接近或低于相应的单基因组。结论：双自杀基因共表达腺病毒载体对VSMCs的抑制作用、安全性及可调控性均优于单基因。     

心肌特异表达基因p93在四种心血管疾病中血清水平的差异及其意义

目的研究心肌特异表达的新激酶基因p93在冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)、扩张性心肌病(DCM)、先天性心脏病(CHD)和风湿性心脏病(RHD)中的作用。方法以杂交瘤技术制备p93单克隆抗体;应用酶联免疫吸附测定(ELISA)直接法检测正常人与上述4种疾病患者血清中p93的表达状况及血清浓度的差异。结果成功制备了人p93单克隆抗体,效价达1:100 000;正常人及CAD、DCM、CHD、RHD患者血清中均有p93的表达;正常人血清水平对数值为2．32±0．19;4种疾病患者的p93血清水平(对数值分别为2．46±0．22,2．47±0．20,2．58±0．26,2．49±0．19)均高于正常人(P<0．05)。其中CHD组明显高于正常对照组及CAD组(P<0．05)。结论p93基因与这4种疾病均有密切关系,以CHD尤为突出。推测该基因可能在上述各疾病的发生、发展过程中起着重要作用,但其机制亟待进一步探讨。     

双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用

目的 观察携带反义凝血酶受体(ATR)和p21的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用，为再狭窄基因治疗寻求新途径。方法 以携带ATR或/和p21的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)，用半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达，MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率。将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉，免疫组织化学法分别检测凝血酶受体(TR)和p21两基因在动脉壁中的表达。结果 RT-PCR结果显示，TR单基因的mRNA表达降低，p2l单基因表达升高，AP双基因得到了共表达；MTT法测定的生长曲线显示，双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因；免疫组织化学证实，AP双基因导入后，TR基因的表达受到完全抑制，p2l基因的表达明显增加，血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制。结论 ATR和p21双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖，在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生。     

Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of Human PRX3 and Its Expression in HEK-293FT Cells

To construct the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 and measure its expression in the HEK-293FT cells, the full-length coding region of human PRX3 was cloned by PCR and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA4-Xpress (A). HEK-293FT cells were transiently transfected with the recombinant plasmid. Western blot and immuofluorescence were used to detect the expression of the fusion protein. In the experiment, restriction analysis identified the construction of the recombinant plasmid and the inserted sequence was identical with that published on GenBank. Western blot and immunofluorescence confirmed the expression of the recombinant protein in transfected HEK-293FT cells. It was concluded that the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 was constructed successfully and the recombinant could he expressed efficiently in HEK-293FT cells, which provides a sound basis for the further study on human PRX3.     

Augmentation of recombinant CH50 polypeptide on the function of macrophages of mice during chemotherapy

CH50 is a Cell I- Hep Ⅱ bifunctional-domain recombinant polypeptide of human fibronectin expressed in E. colilll. This polypeptide can inhibit theinvasion and metastasis of tumor cells 1'n the[2] andactivate the anti--tumor activity of macrophages[']. Ithas been reported that this polypeptide andchemotherapeutic agent have a synergistic inhibitoryeffect on the metastasis of tumors[4J. In this study,we further investigated the effect of CH50 on thefunction of macrophages of mice during chem…     

中国中年人群超敏C反应蛋白与心血管事件、总死亡事件的关联研究

目的 了解超敏C反应蛋白（hs-CRP）与心血管事件、全因死亡事件是否独立相关。方法 2009-2010年在我国12个研究地区各抽取35~64岁调查对象1 000人,实际入选11 623人。收集清晨空腹血标本检测hs-CRP,同时调查心血管病危险因素。2016-2017年对12个地区中的7个地区进行随访,中位随访时间为6.21年（36 075人年）,并记录心血管和死亡事件。总共随访6 177例,排除基线感染者、未进行hs-CRP检测和体格测量的研究对象后,5 984例纳入最终分析。根据hs-CRP值（mg/L）将人群分为3组（<1、1~和>3）。使用Cox比例风险模型,在调整各混杂因素后,探讨hs-CRP与心血管事件及总死亡事件的关联。结果 随访对象平均年龄50.2岁。hs-CRP<1、1~和>3 mg/L 3组人群心血管事件的发生率分别为3.6/1 000人年、7.1/1 000人年和10.4/1 000人年;全因死亡事件发生率分别为3.0/1 000人年、5.7/1 000人年和9.1/1 000人年。调整混杂因素后,与hs-CRP<1 mg/L组相比,hs-CRP 1~和>3 mg/L明显增加心血管事件的发生风险,HR值（95% CI）分别为1.33（0.95~1.84）和1.76（1.20~2.60）,呈明显上升趋势（趋势检验P=0.003）;发生全因死亡风险也明显增加,HR值（95% CI）分别为1.76（1.23~2.54）和2.64（1.74~4.01）,呈明显上升趋势（趋势检验P<0.001）。结论 hs-CRP增高与心血管事件及全因死亡事件呈独立相关。     

多基因共表达载体的构建策略

于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中有广泛的应用价值 ,尤其在针对疾病发生发展的各个环节设计的联合基因治疗方案中 ,构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。目前可提供的载体难以满足这一要求。近年来在多顺反子表达载体的构建策略方面有许多新的进展 ,本文拟对多基因共表达载体的构建策略予以总结和阐述     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin N端片段的原核表达

[目的 ]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白 .[方法 ]设计带有BamHI/EcoRI酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒pGEX 5X Nelin为模板 ,用PCR扩增Nelin基因N端片段 ,并用BamHI/EcoRI酶切PCR产物和原核表达载体 pGEX 5X 1,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒 pGEX 5X Nelin 1,经双酶切鉴定和测序验证 .重组表达质粒转化大肠杆菌BL 2 1,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,以SDS PAGE进行分析 .[结果 ]成功构建并表达了分子量约为 43KD的NelinN端片段的融合蛋白 .[结论 ]所表达的蛋白为蛋白纯化、抗体制备及研究其功能奠定了基础     

重组FN多肽CH50及IFN-γ对化疗小鼠免疫功能影响的比较

腹腔连续注射ＣＨ５０或腹腔内转染ＩＦＮ－γ基因能减弱或防止化疗药物对免疫功能的抑制作用,减轻或防止化疗药物使外周血单核细胞数量和腹腔细胞的数量降低（Ｐ＜０．０５）,促进巨噬细胞代谢活性、杀瘤活性以及分泌细胞因子的能力（Ｐ＜０．０５,＜０．０１）;促进脾淋巴细胞的增殖反应能力（Ｐ＜０．０５,＜０．０１）。注射ＣＨ５０的作用早于ＩＦＮ－γ基因转染的作用。结果提示ＣＨ５０可改善肿瘤化疗药物疗效。     

共表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶双自杀基因杀伤大鼠血管平滑肌细胞的机制研究

目的:研究共表达胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)双自杀基因对大鼠血管平滑肌细胞的杀伤机制.方法:将表达CD和(或)TK的单、双自杀基因重组腺病毒载体分为4组即Ad-EF1α-CD组、Ad-CMV-TK组、Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-lacZ组.感染原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,感染复数为20.给予相应的前体药物5-氟胞嘧啶和脱氧鸟苷后,用四甲基偶氮挫盐微量酶反应比色法(MTI)和流式细胞术分析细胞死亡率.荧光染料Hoechst 33342核染色观察凋亡细胞.琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)的降解.结果:血管平滑肌细胞可被重组腺病毒有效感染(70%).MTF检测发现Ad-EF1α-CD-CMV-TK组双自杀基因及其前体药物[5-氟胞嘧啶(30μg/ml)和脱氧鸟苷(0.3μg/ml)]的细胞毒效应可达91%,高于Ad-CMV-TK组(68%)和Ad-EF1α-CD组(63%)单自杀基因组.流式细胞仪分析Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的杀伤作用是以细胞毒性坏死和凋亡为主.凋亡细胞荧光染色显示Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-CMV-TK组细胞的凋亡率分别为11.0%和12.0%,高于Ad-CMV-LacZ组(1.2%)和Ad-EF1α-CD组(5.0%).琼脂糖凝胶电泳发现在Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的基因组DNA可见到梯样条带.结论:CD/TK双自杀基因对血管平滑肌细胞的杀伤作用大于CD或TK单自杀基因;其杀伤机制是以诱导细胞的坏死和凋亡为主.