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目的 建立稳定干扰长链非编码RNA(lncRNA) LINC01224表达的结直肠癌LoVo和SW620细胞株,并探讨下调LINC01224表达对结直肠癌细胞凋亡的影响。方法 使用GEPIA2数据库分析LINC01224在结直肠癌组织中的表达情况;qPCR法检测LINC01224在10种人结直肠癌细胞中的表达水平。3种不同的LINC01224 siRNA分别转染人结直肠癌LoVo细胞,取抑制LINC01224表达效果最显著的siRNA序列构建LINC01224 shRNA慢病毒载体。在HEK293T细胞内包装成重组慢病毒颗粒,再感染LoVo和SW620细胞,经嘌呤霉素筛选后以有限稀释法获得稳定干扰LINC01224的单克隆细胞。MTS法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 LINC01224在结直肠癌组织中的表达高于正常结直肠组织,其在10种结直肠癌细胞中的表达也高于正常结直肠上皮细胞HCOEPic。siRNA-3对LoVo细胞内LINC01224表达的抑制率高于siRNA-1和siRNA-2。故选择siRNA-3设计LINC01224 shRNA。与对照组(sh-NC组)... 相似文献
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目的 观察死亡相关蛋白激酶(DAPK)蛋白C-末端多肽(DCTP)对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用,探讨DCTP抑制DAPK功能的机制.方法 采用PCR法扩增DCTP核酸片段,定向连接至质粒pEGFPN1、pIRES2-EGFP和pcDNA3.1(-),将重组质粒[pEGFPN1-DCTP、pIRES2-DCTP-EGFP和pcDNA3.1(-)-DCTP]转染至SH-SY5Y细胞中,筛选稳定细胞株.分析pEGFPN1-DCTP的表达产物在细胞中的定位.建立稳定表达DCTP的SH-SY5Y细胞.用MTT法、Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞对谷氨酸的敏感性,用Western blotting检测细胞内DAPK的表达量以及磷酸化DAPK(p-DAPK)水平的变化.结果 谷氨酸对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性,40mmol/L的谷氨酸对细胞的抑制率为51.7%.流式细胞仪检测结果显示,40mmol/L谷氨酸处理后细胞的凋亡率和坏死率分别为26.1%和27.7%,而正常培养细胞分别为0.08%和0%.谷氨酸诱导细胞凋亡时,p-DAPK表达下降.荧光显微镜观察可见DCTP定位于细胞质.用40mmol/L谷氨酸分别诱导转染pcDNA3.1(-)-DCTP和pcDNA3.1(-)质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞,流式细胞仪检测结果显示,前者凋亡率为43.7%,而后者凋亡率为62.2%.Western blotting检测结果显示,在谷氨酸诱导下,与转染pIRES2-EGFP质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞相比,转染pIRES2-DCTP-EGFP质粒的细胞内DAPK和p-DAPK水平均无明显变化.结论 DCTP基因的表达产物定位于SH-SY5Y胞质.DCTP可以抵抗谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,但并不影响DAPK的磷酸化及其表达水平. 相似文献
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目的：建立用高效液相色谱（HPLC）法测定载脂蛋白A‐1（apoA‐1）介导的泡沫细胞内胆固醇流出率的实验方法。方法人单核细胞THP‐1用160 nmol／L佛波酯（PMA）诱导24 h分化为贴壁巨噬细胞（PMA组）,再用50μg／mL乙酰化低密度脂蛋白（ac‐LDL）处理48 h ,诱导巨噬细胞变成泡沫细胞（ac‐LDL组）;加入含apoA‐1的1640培养基培养24 h（apoA‐1组）。油红O染色和HPLC法测定细胞内胆固醇水平,鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型。采用 HPLC分析和液体闪烁计数法测定apoA‐1介导的泡沫细胞内胆固醇流出率。结果 T HP‐1巨噬细胞源性泡沫细胞经油红O染色后,细胞内可明显观察到大量红色脂滴存在。胆固醇水平测定显示,ac‐LDL组内游离胆固醇、总胆固醇和胆固醇酯的水平明显高于 PMA组（P＜0．01）。ac‐LDL处理细胞48 h后,ac‐LDL 组内总胆固醇水平为80．25μg／mg 细胞蛋白,胆固醇酯水平为47．65μg／mg 细胞蛋白,占总胆固醇的59．38％,与PMA组相比,差异有统计学意义（P＜0．01）。 HPLC分析和液体闪烁计数法结果表明,apoA‐1介导泡沫细胞内apoA‐1组胆固醇流出率分别为5．63％和7．08％（P＜0．01）。结论本研究成功建立了酶促反应结合 HPLC测定泡沫细胞内胆固醇流出的方法,为后续研究细胞脂质代谢提供了实验基础。 相似文献
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