死亡相关蛋白激酶C末端对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用研究

目的 观察死亡相关蛋白激酶(DAPK)蛋白C-末端多肽(DCTP)对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用,探讨DCTP抑制DAPK功能的机制.方法 采用PCR法扩增DCTP核酸片段,定向连接至质粒pEGFPN1、pIRES2-EGFP和pcDNA3.1(-),将重组质粒[pEGFPN1-DCTP、pIRES2-DCTP-EGFP和pcDNA3.1(-)-DCTP]转染至SH-SY5Y细胞中,筛选稳定细胞株.分析pEGFPN1-DCTP的表达产物在细胞中的定位.建立稳定表达DCTP的SH-SY5Y细胞.用MTT法、Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞对谷氨酸的敏感性,用Western blotting检测细胞内DAPK的表达量以及磷酸化DAPK(p-DAPK)水平的变化.结果 谷氨酸对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性,40mmol/L的谷氨酸对细胞的抑制率为51.7%.流式细胞仪检测结果显示,40mmol/L谷氨酸处理后细胞的凋亡率和坏死率分别为26.1%和27.7%,而正常培养细胞分别为0.08%和0%.谷氨酸诱导细胞凋亡时,p-DAPK表达下降.荧光显微镜观察可见DCTP定位于细胞质.用40mmol/L谷氨酸分别诱导转染pcDNA3.1(-)-DCTP和pcDNA3.1(-)质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞,流式细胞仪检测结果显示,前者凋亡率为43.7%,而后者凋亡率为62.2%.Western blotting检测结果显示,在谷氨酸诱导下,与转染pIRES2-EGFP质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞相比,转染pIRES2-DCTP-EGFP质粒的细胞内DAPK和p-DAPK水平均无明显变化.结论 DCTP基因的表达产物定位于SH-SY5Y胞质.DCTP可以抵抗谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,但并不影响DAPK的磷酸化及其表达水平.     

饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸对肺癌细胞增殖与自噬的影响

目的 研究饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸对肺癌细胞增殖与自噬的影响.方法 用0、30、60、120、240μmol/L硬脂酸(饱和脂肪酸)和DHA(不饱和脂肪酸)分别处理肺癌细胞A549,绘制细胞生长曲线并计算克隆形成率以检测细胞增殖.采用硬脂酸和DHA分别处理A549细胞24h后,采用激光共聚焦显微镜从形态学方面观察细胞自噬情况.采用硬脂酸和DHA分别处理A549细胞12、24、36h后,用Western blotting检测细胞自噬相关蛋白的表达.结果 30~240μmol/L硬脂酸和DHA均有抑制A549细胞增殖的作用(P<0.05),硬脂酸、DHA处理A549细胞24h后均检测到细胞出现明显的自噬;Western blotting结果 显示,硬脂酸、DHA分别处理A549细胞12、24、36h后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(ser2481)磷酸化水平降低(P<0.05).结论 饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸均有抑制肺癌细胞增殖、诱导肺癌细胞自噬的作用,其机制可能与p-mTOR(ser2481)信号通路有关.     

SIRT1对肺癌A549细胞增殖和迁移的影响

目的 通过调节肺癌A549细胞中沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达,探讨SIRT1对肺癌细胞增殖和转移的影响及其分子机制.方法 培养肺癌A549细胞,用重组腺病毒感染A549细胞上调/下调SIRT1的表达;通过MTT实验、克隆形成实验、划痕实验和Transwell迁移实验检测上调/下调SIRT1表达对肺癌A549细胞增殖和转移的影响;干扰SIRT1表达后用Western blot检测SIRT1对肺癌A549细胞中上皮细胞向间质细胞转化(EMT)相关蛋白标记物ZO-1、β-连环蛋白(β-catenin)、Snail和ZEB1表达的影响.结果 上调/下调SIRT1表达对肺癌A549细胞增殖无明显影响,但是可以促进/抑制肺癌A549细胞迁移;下调SIRT1表达后EMT相关上皮性标记蛋白ZO-1表达增多,间质性标记蛋白β-catenin、Snail和ZEB1表达减少.结论 SIRT1可能通过影响EMT相关标记蛋白的表达促进肺癌A549细胞迁移.     

高良姜素诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡的研究

目的:研究高良姜素诱导肝癌细胞系BEL-7402细胞凋亡.方法:MTT法测定BEL-7402细胞毒性及细胞生长,荧光显微镜观察细胞形态学的变化,流式细胞仪分析细胞周期和线粒体膜电位的变化.发色底物法检测Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性变化.结果:高良姜素对BEL-7402细胞IC50为30.15 mg/L,BEL-7402细胞生长曲线表明,高良姜素浓度增高,生长率明显下降.细胞凋亡可在20～80 mg/L高良姜素处理后24 h出现.凋亡细胞主要表现为核染色质固缩,荧光染色增强.高良姜素阻断细胞于G.期,线粒体膜电位降低.Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9被激活,呈时间依赖性改变.高良姜素处理BEL-7402细胞6 h时Caspase-9活性最高,而Caspase-6活性在12 h达峰值,Caspase-3活性峰值时间在18 h.结论:高良姜素可以诱导BEL-7402细胞发生凋亡,其途径可能是通过线粒体旁路.     

丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化

 目的 分析丁酸钠诱导Raji细胞的基因表达变化,探讨丁酸钠诱导凋亡作用机制。方法 限制性显示PCR技术（Restriction Display PCR,RD-PCR）分析基因表达变化,利用互联网提供的GenBank核酸数据库分析比对获得的差异表达序列。结果 获得14条差异表达序列,其中6条是对照组高表达序列,8条是实验组高表达序列。结论 采用RD-PCR技术可以快速简便地分析药物诱导基因表达变化。分析表达差异的序列发现,丁酸钠可诱导促进细胞凋亡的基因表达,降低肿瘤细胞高表达的基因表达。     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

根皮素抑制肝癌细胞恶性表型的研究

目的：探讨根皮素对肝癌BEL-7402细胞株运动、侵袭、粘附、克隆形成率的影响。方法：MTT法和Costar Transwell检测根皮素抑制BEL-7402细胞的增殖、运动、侵袭、粘附、克隆形成率。结果：根皮素能抑制BEL-7402细胞的增殖、侵袭、运动、粘附及克隆形成能力,并呈现出剂量依赖性。结论：根皮素能抑制BEL-7402细胞的恶性表型。     

鲎素诱导HL-60细胞凋亡的机制探讨

目的 研究鲎素诱导HL-60细胞凋亡时,半胱氨酸蛋白酶(Caspases)活性的变化,探讨鲎素诱导HL-60细胞凋亡的可能机制.方法 以鲎素20 μg/ml处理HL-60细胞0～24 h.流式细胞仪检测线粒体膜电位.Western blot法和发色底物法检测Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和Caspase-9活性变化.Western blot法检测胞质中细胞色素C的变化.结果 鲎素处理HL-60细胞后,线粒体膜电位下降.Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和Caspase-9被激活,呈时间依赖性改变.鲎素处理HL-60细胞6 h Caspase-8活性最高,而Caspase-9在12 h活性最高,Caspase-6活性在18 h达峰值,Caspase-3活性峰值时间在24 h后.胞质中细胞色素C含量呈时间依赖性增加.结论 鲎素诱导HL-60细胞凋亡可能是多途径的,至少与线粒体途径和死亡受体途径相关.     

鲎素的抗菌作用

目的 利用从鲎试剂生产废料中提取出的鲎素,了解鲎素对大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌的抑菌作用.方法 用酸处理和Sephdex G-50 凝胶层析法从鲎试剂生产废料中提取分子量约为3KD的鲎素,然后把鲎素加入菌液培养,24 h后测定结果.结果 鲎素能显著抑制大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌的生长,其24 h最小有效抗菌浓度分别为:0.23,0.23,1.88 μg/ml.结论 鲎素具有抗菌作用,可作为新一代的抗菌药物进行开发研究.     

根皮素诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡

目的 研究根皮素诱导肝癌细胞系BEL-7402细胞凋亡.方法 MTT法测定BEL-7402细胞毒性,荧光显微镜观察细胞形态学的变化,流式细胞仪分析细胞周期和线粒体膜电位的变化.发色底物法检测Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性变化.结果 根皮素对BEL-7402细胞IC50在89.23 μg/mL.BEL-7402细胞生长曲线表明,根皮素浓度增高,生长率明显下降.细胞凋亡可在40～160 μg/mL根皮素处理后24 h出现.凋亡细胞主要表现为核染色质固缩,荧光染色增强.根皮素阻断细胞于G1期,线粒体膜电位降低.Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9被激活,呈时间依赖性改变.根皮素处理BEL-7402细胞12 h Caspase-9活性最高,而Caspase-6活性在18 h达峰值,Caspase-3活性峰值时间在24h后.结论 根皮素可以诱导BEL-7402细胞发生凋亡,途径可能是通过线粒体旁路.