人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定

目的：高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法：人工合成经密码子优化的NGAL基因,构建原核表达重组质粒pW28-NGAL,IPTG诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的rhNGAL抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争ELISA法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE分析纯度;最后运用Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果：高效获得高纯度NGAL重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得6株高效价单克隆抗体;其中,25号单抗为IgG1亚型,余者均属IgG2a亚型,且19、35号单抗的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109。SDS-PAGE分析表明纯度均大于90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论：本研究利用密码子优化技术高效表达制备了NGAL重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为NGAL的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。     

提高妇产科科研型研究生病历书写能力的探讨

妇产科作为临床医学教育中的主干课程之一,既具备了所有外科的普遍特点,又有自身专科的特殊性［1］。妇产科科研型研究生培养工作主要分为两个阶段：基础理论学习阶段和临床实习阶段。临床实习是医学教育的重要环节,是将理论联系实际的关键时期。病历书写作为临床实习中最基础的环节,其优劣体现了学生基本功是否扎实,是每名妇产科研究生必须掌握的最基本技能,也是实习中要掌握的重点内容［2］。然而,随着现代化检测手段在临床中应用得越来越广泛,许多学生忽视了基本功的训练［3］。另外,妇产科科研型研究生刚进入临床,对病历书写认识不深,缺少训练。因此,需从研究生初入临床实习阶段就开始培养他们病历书写的能力,以加强其基本功的训练。     

雌二醇对人羊膜间充质干细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究不同浓度雌二醇（estradiol,E2）对人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stromal cells,HAMSCs）体外培养中增殖、凋亡的影响。方法：采用改良酶消化法提取HAMSCs,流式细胞学方法和免疫荧光法鉴定提取细胞。HAMSCs培养方法分为对照组和E2组（分别加入浓度为10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L E2）。CCK-8检测各组HAMSCs增殖情况;qRT-PCR检测干细胞特异基因Oct-4和凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：CCK-8检测显示各浓度E2组和对照组的HAMSCs增殖活性在1~6 d都随时间的变化而变化（F时间=2 418.132,P时间=0.000）;各浓度E2组在1~4 d的增殖率与对照组无明显差异;4 d后,各浓度E2组的增殖率明显高于对照组（F组别=246.601,P组别=0.000）,各浓度组间无明显差异。qRT-PCR检测显示10-6 mol/L E2组（1.00±0.10）的Oct-4 mRNA表达水平较对照组（0.58±0.16）和其他E2浓度组（1.31±0.22、0.81±0.04、0.78±0.07）上调（P=0.000,P=0.020,P=0.001,P=0.000）;除10-6 mol/L E2组（0.83±0.47,P=0.084）外,其他E2浓度组（0.49±0.25、0.38±0.19、0.32±0.10）抗凋亡基因Bcl-2基因表达量均较对照组（1.06±0.13）下调（P=0.038,P=0.015,P=0.010）。10-5 mol/L E2组（2.20±0.58）的Bax基因较对照组、其他E2浓度组（1.00±0.05、1.52±0.38、1.38±0.17、1.17±0.19）上调（P=0.001,P=0.028,P=0.012,P=0.003）。Western blot检测提示10-5 mol/L E2组（0.514±0.014）的促凋亡蛋白表达Bax较对照组（0.201±0.017）明显上调（P=0.000）,而抗凋亡蛋白Bcl-2（0.366±0.024）与对照组（0.215±0.080）之间差异无统计学意义（P=0.055）。而10-6 mol/L E2组（0.378±0.016）的促凋亡蛋白Bax较其他浓度E2组（0.514±0.014、0.547±0.036、0.577±0.028）表达降低（P=0.000）。结论：E2促进HAMSCs的增殖呈时间依赖性,高浓度E2（10-5 mol/L）促进HAMSCs凋亡,较高浓度E2（10-6 mol/L）维持HAMSCs活性并保护其分化潜能。     

LncRNA HOXB-AS3在骨髓增生异常综合征中的表达及临床意义

目的 检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者血清长链非编码RNA HOXB AS3（LncRNA HOXB AS3）水平,并探讨其与MDS的关系。方法 选取2017年3月~2019年12月于本院门诊就诊或住院治疗的74例MDS患者作为MDS组,再将74例MDS患者按照国际预后积分系统（IPSS）重新分为低危组、中危Ⅰ组、中危Ⅱ组和高危组,同时按照WHO分级重新分为难治性贫血型（RA）组、难治性血细胞减少伴多系发育异常型（RCMD）组、难治性贫血伴原始细胞增多 Ⅰ型（RAEB Ⅰ）组和难治性贫血伴原始细胞增多 Ⅱ型（RAEB Ⅱ）组;同时选取同期68例健康体检人群作为对照组。采用实时荧光定量PCR（qRT PCR）法检测血清中LncRNA HOXB AS3水平;分析血清HOXB AS3 mRNA表达与IPSS评分的关系;分析血清HOXB AS3 mRNA表达与WHO分级的关系;分析血清中HOXB AS3 mRNA水平对MDS的诊断价值。结果 MDS组血清中HOXB AS3 mRNA表达水平显著高于对照组（P＜0.05）;高危组血清中HOXB AS3 mRNA表达水平显著高于低危组、中危Ⅰ组和中危Ⅱ组（P＜0.05）;RAEB Ⅱ组血清中HOXB AS3 mRNA表达水平显著高于RA组和RCMD组（P＜0.05）;HOXB AS3 mRNA表达水平与IPSS评分、WHO分级均呈正相关（r=0550、0597,P均＜0.05）。结论 血清LncRNA HOXB AS3表达可能对MDS的发生具有预测作用,对评估病情发展状况有重要意义,可为MDS的早期干预提供一定参考依据。     

分化抑制因子1重组腺病毒的构建及其动物模型的建立

目的：构建分化抑制因子-1（inhibitor 1 of differentiation, Id1）重组腺病毒（recombinant adenovirus,Rad）,并建立Id1过表达的小鼠动物模型。方法：在HEK293细胞中将腺病毒重组质粒AdEasy-Id1进行包装以获得Id1重组腺病毒（RAd-Id1）;通过绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定腺病毒滴度;通过qRT-PCR和Western blot验证RAd-Id1感染的HepG2 细胞中的Id1过表达效果,用MTS比色法检测RAd-Id1对HepG2细胞增殖的影响;通过尾静脉注射RAd-Id1的感染方式建立肝组织中过表达Id1的小鼠动物模型,病毒载量梯度实验分PBS空白组、RAd-GFP对照组及RAd-Id1实验组（n=5/组）以测定RAd-Id1感染小鼠的适合载量;病毒感染时间梯度实验每5 d检测1次为1组,共7组（n=5/组）以测定感染小鼠的适合时间;通过Western blot检测小鼠肝组织中Id1的过表达效果及甲胎蛋白（alpha fetal protein,AFP）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）的表达水平,再采用ELISA检测小鼠血清中Id1的免疫原性及AFP和CEA的表达情况。结果：成功包装获得RAd-Id1,测得其滴度为1.5×1011 GFU/mL;RAd-Id1感染HepG2细胞48 h和72 h后,Id1的转录和蛋白水平均明显升高（P<0.01）;96 h时RAd-Id1实验组的MTS检测值较PBS空白组和RAd-GFP对照组（2.00±0.06 vs. 1.18±0.05,2.00±0.06 vs. 1.10±0.07;F=51.350,P=0.000）明显升高;Western blot结果显示：在RAd-Id1感染的小鼠肝组织中,Id1、AFP和CEA蛋白水平较PBS空白组和RAd-GFP对照组升高;ELISA实验结果表明：血清中AFP和CEA蛋白水平与RAd-Id1的载量呈正相关（rs AFP=0.903,PAFP=0.014;rs CEA=0.964,PCEA=0.002）,不同载量RAd-Id1感染小鼠的血清中Id1抗体滴度无显著差异（P>0.05）。结论：成功构建了RAd-Id1及其介导的小鼠动物模型;RAd-Id1可作为细胞水平上研究Id1对肝癌影响的载体工具;AFP和CEA的升高提示Id1可能参与诱导AFP和CEA的表达。     

乙型肝炎病毒复制对肝细胞Id家族表达的影响

目的：研究肝细胞中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制对分化抑制因子（inhibitor of differentiation,Id）家族表达的影响。方法：利用qRT-PCR、Western blot检测分析Id家族在HBV瞬时或稳定复制的肝癌细胞中表达水平的变化,并在HBV复制质粒PCH9-HBV1.1转染的正常肝细胞和HBV转基因小鼠肝组织细胞模型中进一步验证。将乙型肝炎病毒S蛋白（hepatitis B virus S protein,HBs）、乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein,HBc）、乙型肝炎病毒DNA聚合酶（hep－atitis B virus DNA polymerase,HBp）、乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）的过表达质粒转染HepG2细胞,检测各组与载体对照组细胞中Id家族表达水平的变化,分析比较乙肝病毒编码的4种蛋白对Id家族的调控作用。利用荧光素酶报告基因检测病毒各组分蛋白对Id蛋白启动子活性的影响。结果：瞬时转染HBV表达质粒的HepG2细胞较对照组细胞,Id1、Id3的mRNA和蛋白表达水平均降低（mRNA：t=3.952、3.189,P=0.017、0.033;蛋白：t=10.532、4.155,P=0.000、0.014）;HepG2.2.15中Id1、Id3 mRNA和蛋白的表达水平较HepG2对照组均下降（mRNA：t=5.553、7.211,P=0.005、0.002;蛋白：t=4.193、3.849,P=0.014、0.018）;HepAD38（Tet-）中Id1、Id3蛋白的表达量较 HepAD38（Tet+）组均降低（t=3.052、3.712,P=0.038、0.021）。同时,HBV的复制可以抑制LO2细胞及小鼠肝组织中Id1、Id3的表达（mRNA：t=14.564、3.281、3.489、3.495,P=0.000、0.030、0.025、0.025;蛋白：t=5.651、5.336、4.948、5.149,P=0.005、0.006、0.008、0.007）。转染HBV病毒各编码蛋白质粒的HepG2细胞中,HBc组Id1、Id3较载体对照组的mRNA表达水平降低最明显（77.7%、76.2%,F=9.945、37.528,t=6.481、10.915,P=0.000、0.000）,Western blot结果显示HBx组Id1、Id3蛋白表达量下降最明显（86.2%、68.4%,F=38.225、7.159,t=12.550、5.295,P=0.000、0.001）。双荧光素酶报告基因检测结果表明,HBc组Id1、Id3启动子活性较对照组降幅最大（62.2%、56.3%,F=16.530、5.210,t=5.442、3.222,P=0.000、0.019）。结论：乙型肝炎病毒可以抑制肝组织、细胞中Id1及Id3的表达,其中HBc对Id1、Id3 mRNA的下调最明显,HBx则对Id1、Id3 蛋白水平上的抑制作用最明显。     

PPCNg介导人羊膜间充质干细胞治疗大鼠宫腔粘连的研究

目的：探讨PPCNg聚合物（polyethylene glycol citrate-co-N-isopropylacrylamide gelatin,PPCNg）介导人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）治疗宫腔粘连（intrauterine adhesions,IUA）的可行性和有效性。方法：将PKH26标记的hAMSCs在不同浓度PPCNg中培养,48 h后荧光显微镜下观察细胞状态,CCK-8法分析细胞毒性,评价PPCNg的材料毒性。雌性SD级大鼠随机分为假手术组、单纯IUA模型组（模型组）、PPCNg治疗IUA组（PPCNg组）、hAMSCs治疗IUA组（hAMSCs组）及PPCNg联合hAMSCs治疗IUA组（PPCNg+hAMSCs组）。建立IUA模型2周后,假手术组不处理,其余建模的各组分别宫腔内注射PBS、PPCNg、hAMSCs的PBS悬液及hAMSCs的PPCNg悬液。宫腔注射2周后,行子宫组织石蜡切片HE染色和Masson染色检测子宫内膜腺体及纤维化情况,免疫组化检测子宫内膜中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、波形蛋白（vimentin,VIM）、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA）、细胞角蛋白19（cytokeratin 19,CK19）及E-钙粘附蛋白（E-cadherin,E-Ca）表达情况;冰冻切片荧光显微镜下观察子宫内膜中hAMSCs分布情况。结果：①在不同浓度PPCNg中hAMSCs贴壁生长,状态良好;②PPCNg无细胞毒性,材料毒性分级为1级（合格）;③与假手术组相比,模型组腺体数目减少（P=0.000）,纤维化面积比增高（P=0.000）;与模型组相比,PPCNg组、hAMSCs组及PPCNg+hAMSCs组的腺体数目不同程度增多（P=0.000）,纤维化面积比不同程度减少;④与模型组相比,PPCNg组、hAMSCs组及PPCNg+hAMSCs组TGF-β1、VEGF、VIM及α-SMA的表达均不同程度降低,其中PPCNg+hAMSCs组明显降低（P=0.000）,而CK19及E-Ca表达则不同程度升高,其中PPCNg+hAMSCs组明显升高（P=0.000）;⑤PPCNg+hAMSCs组PKH26标记的hAMSCs远远多于hAMSCs组。结论：PPCNg无细胞毒性,能显著提高hAMSCs治疗IUA的有效性。     

葡萄糖调节蛋白GRP78与HBV的PreS1相互作用位点的初步研究

目的：初步研究78 kD的葡萄糖调节蛋白（the 78 kD glucose-regulated protein,GRP78)与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的前S1蛋白（PreS1）的相互作用位点。方法：利用PCR技术扩增GRP78的基因,将扩增的目的基因克隆至pW28载体质粒,在大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）B834中表达,经过镍离子亲和层析柱纯化GRP78蛋白;将PreS1 3个截短片段的重组质粒（pGST-PreS1-X1/X2/X3）在B834中表达后,经过GST亲和层析柱纯化相应蛋白;利用蛋白质体外结合实验（pull down）、微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）检测GRP78与 PreS1 3个截短片段的相互作用。结果：成功构建重组质粒pW28-GRP78;获得GRP78蛋白及PreS1 3个截短片段的融合蛋白;pull down及MST实验验证了GRP78可以与PreS1的3个片段结合,且GRP78与GST-PreS1-X1结合效果最好。结论：利用分子克隆技术及蛋白质表达纯化技术,获得GRP78蛋白及PreS1截短片段的融合蛋白,并初步筛选了PreS1与GRP78的相互作用位点,为后续研究打基础。