人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定

目的：高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法：人工合成经密码子优化的NGAL基因,构建原核表达重组质粒pW28-NGAL,IPTG诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的rhNGAL抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争ELISA法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE分析纯度;最后运用Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果：高效获得高纯度NGAL重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得6株高效价单克隆抗体;其中,25号单抗为IgG1亚型,余者均属IgG2a亚型,且19、35号单抗的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109。SDS-PAGE分析表明纯度均大于90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论：本研究利用密码子优化技术高效表达制备了NGAL重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为NGAL的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。     

2009～2012年重庆医科大学附属第一医院粪肠球菌和屎肠球菌耐药性监测

目的 了解2009~2012年重庆医科大学附属第一医院临床分离的粪肠球菌和屎肠球菌对各类抗菌药物的耐药性。方法 临床分离病原菌按统一方案进行细菌药物敏感试验,根据2012年版临床实验室标准化协会(CLSI)指导原则判读细菌的药物敏感试验结果,采用WHONET5.6软件对数据进行分析。结果 共分离到非重复粪肠球菌783株,屎肠球菌664株,二者对利奈唑胺和万古霉素非常敏感(耐药率均低于2.0%),粪肠球菌和屎肠球菌对万古霉素耐药率分别为0.1%和1.4%。粪肠球菌对青霉素、氨苄西林和呋喃妥因的耐药率较低,分别为5.7%、2.6%和2.2%;对庆大霉素的耐药率为32.9%。屎肠球菌对青霉素和氨苄西林的耐药率均在90.0%以上。结论 重庆医科大学附属第一医院肠球菌感染以粪肠球菌为主,监测其耐药情况对指导临床合理用药具有重要意义。     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0414的表达纯化及保守性分析

目的:获得纯化的肺炎链球菌(S.pn)重组假想蛋白SPD0414,并分析其在常见S.pn菌株中的保守性。方法:利用PCR方法扩增SPD0414蛋白胞外区核酸序列,将其克隆到原核表达载体ppSUMO内,转化到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白特异性及纯度。通过纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备其多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western blot方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在6种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果:克隆的SPD0414序列与Gene Bank中的数据相符,并实现了重组SPD0414蛋白高水平的可溶表达纯化蛋白免疫BALB/c小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western blot验证SPD0414蛋白在6株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论:成功制备了高滴度、高特异性的SPD0414多克隆抗体,证实了SPD0414在肺炎链球菌不同菌株间保守性较高,为肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。     

2012年度某院患者无菌体液耐药性监测的调查

目的 了解2012年度该院患者无菌体液的细菌分布和对抗菌药物的耐药性.方法 对临床送检的无菌体液标本按常规进行病原菌分离,采用Vitek2-Compact系统和ATB Express系统进行鉴定,测定抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）值,采用纸片扩散法（K-B）进行微生物敏感性试验.应用WHONET 5.6软件进行数据分析.结果 分离菌株556株,革兰阴性菌316株（57%）,革兰阳性菌226株（40%）.常见细菌分别为大肠埃希菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的检出率分别为53.3%和21.1%;检出9株金黄色葡萄球菌,其中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（66%）;耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（74%）.未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌.未发现对万古霉素耐药的肠球菌属细菌.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类耐药的检出率分别为3.8%和3.8%.结论 及时监测病原菌的菌群种类、分布和耐药变迁以指导临床合理、规范地使用抗菌药物.     

多药耐药铜绿假单胞菌的目标性监测

目的了解多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)的科室分布及耐药性,探索其医院感染的预防与控制策略。方法对2012年医院分离的多药耐药铜绿假单胞菌采用法国生物梅里埃公司VITEK-2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行细菌鉴定及药敏分析,并进行目标性监测,制定目标监测管理方案,建立危急值管理流程,实施医院感染的预防与控制策略。结果 2012年分离出铜绿假单胞菌共837株,多药耐药铜绿假单胞菌检出84株,检出率10.0%;科室主要分布在ICU、神经内科、老年科、泌尿外科,分别占27.4%、20.2%、15.5%、11.9%;标本主要来源于痰液、尿液及分泌物,分别占65.5%、17.9%、7.1%;84株多药耐药铜绿假单胞菌对临床常用抗菌药物的耐药率均>50.0%;全年未发生医院感染暴发与流行。结论多药耐药铜绿假单胞菌的检出率和耐药率较高,制定并落实目标监测管理方案,及时实施医院感染的预防与控制策略,能有效预防多药耐药铜绿假单胞菌的暴发和流行。     

maspin诱导不同分化的胃癌细胞凋亡及可能的作用机制

目的探讨maspin诱导胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45凋亡的作用及可能的作用机制。方法重组质粒pCD-NA3.1-maspin分别转染胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Westernblotting)检测maspin基因表达,末端标记细胞凋亡法(TUNEL)检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的改变。结果重组质粒pCDNA3.1-maspin导入SGC-7901和MKN-45细胞株后,maspin的mRNA和蛋白表达均明显增强(P<0.05),两种细胞均出现明显的细胞凋亡,且两种细胞中的Bax蛋白均上调,而Bcl-2蛋白均下调。结论 maspin基因可能通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白诱导胃癌细胞凋亡。     

尿路感染住院患者中大肠埃希菌的耐药性分析

目的了解该院住院患者泌尿道标本中分离的119株大肠埃希菌的耐药情况,为临床治疗合理使用抗菌药物提供依据。方法对该院119例做了药敏分析的大肠埃希菌进行回顾性分析,采用梅里埃Vitek-2Compact全自动微生物分析仪进行细菌鉴定及药敏试验,参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100-S24文件标准判读结果,并采用WHONET5.6和SPSS23.0软件对实验结果进行统计分析。结果该院2015年10月至2016年10月119株大肠埃希菌氨苄西林和复方磺胺甲噁唑的耐药率为85.71%和100.00%(75.00%)。头孢替坦、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南、呋喃妥因和阿米卡星的敏感率高,均75.00%。同时检出75株耐产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌,检出率为63.02%;1株碳青霉烯类(CRE)耐药的大肠埃希菌,占0.84%。17种常见抗菌药物有8种药物(氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星)在产和非产ESBLs的菌株中存在耐药性差异;5种药物(头孢替坦、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星和左氧氟沙星)在不同性别患者分离株中存在耐药性差异。结论大肠埃希菌是泌尿道最常见的致病菌,经验用药可以选择头孢替坦、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南、呋喃妥因和阿米卡星,但应注意药物肾毒性。实验室应加强对大肠埃希菌耐药菌株的分析和药敏监测,避免医院感染的暴发。     

分化抑制因子1重组腺病毒的构建及其动物模型的建立

目的：构建分化抑制因子-1（inhibitor 1 of differentiation, Id1）重组腺病毒（recombinant adenovirus,Rad）,并建立Id1过表达的小鼠动物模型。方法：在HEK293细胞中将腺病毒重组质粒AdEasy-Id1进行包装以获得Id1重组腺病毒（RAd-Id1）;通过绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定腺病毒滴度;通过qRT-PCR和Western blot验证RAd-Id1感染的HepG2 细胞中的Id1过表达效果,用MTS比色法检测RAd-Id1对HepG2细胞增殖的影响;通过尾静脉注射RAd-Id1的感染方式建立肝组织中过表达Id1的小鼠动物模型,病毒载量梯度实验分PBS空白组、RAd-GFP对照组及RAd-Id1实验组（n=5/组）以测定RAd-Id1感染小鼠的适合载量;病毒感染时间梯度实验每5 d检测1次为1组,共7组（n=5/组）以测定感染小鼠的适合时间;通过Western blot检测小鼠肝组织中Id1的过表达效果及甲胎蛋白（alpha fetal protein,AFP）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）的表达水平,再采用ELISA检测小鼠血清中Id1的免疫原性及AFP和CEA的表达情况。结果：成功包装获得RAd-Id1,测得其滴度为1.5×1011 GFU/mL;RAd-Id1感染HepG2细胞48 h和72 h后,Id1的转录和蛋白水平均明显升高（P<0.01）;96 h时RAd-Id1实验组的MTS检测值较PBS空白组和RAd-GFP对照组（2.00±0.06 vs. 1.18±0.05,2.00±0.06 vs. 1.10±0.07;F=51.350,P=0.000）明显升高;Western blot结果显示：在RAd-Id1感染的小鼠肝组织中,Id1、AFP和CEA蛋白水平较PBS空白组和RAd-GFP对照组升高;ELISA实验结果表明：血清中AFP和CEA蛋白水平与RAd-Id1的载量呈正相关（rs AFP=0.903,PAFP=0.014;rs CEA=0.964,PCEA=0.002）,不同载量RAd-Id1感染小鼠的血清中Id1抗体滴度无显著差异（P>0.05）。结论：成功构建了RAd-Id1及其介导的小鼠动物模型;RAd-Id1可作为细胞水平上研究Id1对肝癌影响的载体工具;AFP和CEA的升高提示Id1可能参与诱导AFP和CEA的表达。     

2012年重症监护病房细菌耐药监测

目的了解2012年重症监护室病房(ICU)患者临床主要分离细菌的耐药性。方法采用自动化仪器法和纸片扩散法测定抗菌药物敏感性,参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012年版判定标准判读结果,用WHONET5.6软件统计分析。结果 2012年共收集ICU病房非重复临床分离株1 374株,其中革兰阴性菌1 089株(79.3%),革兰阳性菌285株(20.7%);分离率排在前5位的细菌依次为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌;肠杆菌科细菌对亚胺培南和厄它培南出现耐药株;检出2株万古霉素耐药的屎肠球菌。结论该院ICU病房细菌来源以非发酵菌、肠杆菌科细菌、葡萄球菌属为主,耐药性比较严重,必须重视抗菌药物的合理使用,加强细菌耐药监测。