中华骨髓库HLA分型质控工作中分型结果错误原因的分析及探讨

目的对中国造血干细胞捐献者资料库（简称中华骨髓库）中人类白细胞抗原（HIA）分型数据质控抽枪中发现的错误分型情况进行归纳总结，探讨其产生的原因及解决策略，以提高造血干细胞捐献者HLA分型的准确性。方法采用聚合酶链反应（PCR）-序列特异件引物（sequence specific primers, SSP） 、PCR-序列特异性寡核苷酸探针（sequence specific oligonucleotide probes, SSOP）及基因测序（ sequence based typing,SBT）分型方法，对中华骨髓库按比例随机抽取的7313份已完成HLA-A、B、DRB1基因分型的标本进行复检，使用与所抽检标本原始分型试剂小同的试剂盲检，对结果不符者，采用第3种试剂及其原始分型试剂复检；对于难以确定的结果，采用SBT方法确认。采用直接计数法进行HLA差错统计。结果质控抽检6期共7313份标本，发现HLA分型结果错误标本数183份，平均错误率为2．50％。HLA基因分型错误率逐年降低，6期错误率分别为8．18％、3．84％、2．85％、1．70％、1．10％、0．84％。HLA-A位点错误率为0．49％，其中漏检现象占A位点错误的61．11％；HLA-B位点错误率为0．85％，其中以同一宽特异性组之间的业型判断错误者居多，占B位点错误的41．94％；HLA-DRB1位点错误率为0．66％；另外，可能由于标本搞错导致的HLA-A、B、DRB1 3个位点分型全错有41例，错误率为0．56％。结论错误产生的原因有实验人员的技术操作水平及工作责任心上的原因，也有分型方法及试剂本身的原因。采用DNA分型技术，使用特异性、重复性好的合格试剂及加强质控监督，有助于提高HLA分型的准确性，并将有助于提高骨髓库造血干细胞捐献者HLA分型的质量。     

中国汉族人群FUT2基因385位点突变与Lewis表型的相关性

目的 分析中国汉族人群分泌型基因(FUT2)385位点突变与Lewis表型的相关性。方法 对73例中国汉族人进行Lewis血型血清学鉴定。采用SSP法对73例标本的FUT2基因进行385位点突变筛检，并用测序法验证。结果 385T突变发生率为54．79％。个体FUT2基因385T为纯合子且Lewis为阳性时，其Lewis表型为Le(a b )和Le(a b-)，Le(a b-)表型占总数的17．8％，Le(a b )占8．2％。结论 FUT2基因A385T的纯合子突变是Le(a b )和Le(a b-)表型的遗传基础。     

Diego血型基因分型技术的研究及应用

传统的Dia和Dib相应的ISBT符号为DI1和DI2,这是Diego血型系统中最具有临床意义的一对抗原.Diego血型系统抗原相应的抗-Dia可以引起新生儿溶血病,也可以破坏输入的Dia抗原红细胞,抗-Dib非常罕见,但同样能引起新生儿溶血病(HDN)和溶血性输血反应,具有临床意义,Dia和Dib抗原可以用血清学方法鉴定,但试剂较为昂贵,特别是抗-Dib定型试剂,市场上更是难以购买,且临床因产生抗-Dib所引起的输血问题,寻找相合的血源是非常困难的,我国随机人群中调查DI1基因频率为0.0357,DI2基因频率为0.9643,Di(a+b-)表现型的人低于千分之一[1],因此,笔者建立了Diego血型基因分型技术,并用于临床Diego血型的鉴定,以及Di(a+b-)献血员的筛检.     

2 210例江西籍汉族骨髓供者的HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型频率

目的分析江西汉族骨髓供者人类白细胞抗原(HLA)-A、B、DRB1等位基因频率和HLA单倍型频率。方法根据2210例江西汉族无关骨髓供者的HLA基因型数据,采用最大似然性方法计算HLA-A、B、DRB1的基因频率和单倍型频率。结果江西汉族骨髓供者中共观察到72个HLA等位基因,其中A*02、A*11、A*24、A*33、B60、B*46、B*13、B*58、B*51、B75、B62、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15、DRB1*04、DRB1*08、DRB1*11、DRB1*14和DRB1*13的频率高于0.05。358条A-B单倍型中,A2-B46、A11-B60、A33-B58等26条单倍型的频率高于0.01,68条单倍型表现为显著的正连锁不平衡;420条B-DR单倍型中,B46-DR9、B13-DR15、B75-DR12等22条单倍型频率高于0.01,82条单倍型表现为显著的正连锁不平衡;2518条A-B-DR单倍型中,386条单倍型有意义(频率大于等于4.52×10-4),A2-B46-DR9、A2-B46-DR8、A11-B13-DR15、A33-B58-DR13、A33-B58-DR17、A30-B13-DR7等39条单倍型频率高于0.005。结论江西汉族HLA-A、B、DRB1等位基因和HLA单倍型的分布特征接近南方汉族人群,但又有其自身特殊性,本研究群体的HLA等位基因频率和单倍型频率可作为江西汉族人群的参考标准。     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的 研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA 流式磁珠基因分型.方法 使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度.结果 从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229.琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb.结论 本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验.     

一个AB型开米拉家系遗传状态的研究

为了研究罕见开米拉血型家系的基因遗传状态,对先证者家系部分样本进行ABO基因序列测定,用流式反向序列特异性寡核苷酸探针方法测定HLA-A、B、DRB1基因位点,用PCR-序列特异性引物法测定HLA-A、B、DRB1基因位点,对16个短串联重复片段位点进行荧光标记复合扩增。结果发现：A3B3型家系的2个体中,ABO基因、HLA-B、DRB1基因、多个STR位点出现了2个以上的等位基因。结论：利用基因分型技术分析开米拉血型能清楚地提示此罕见血型的遗传状态,增进了对此遗传方式的认识。     

中国北方汉族急性白血病和慢性粒细胞白血病患者HLA等位基因及单倍型研究

目的 研究中国北方汉族急性白血病(AL)和慢性粒细胞白血病(CML)患者人群中人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型的分布差异.方法 根据1 270例中国北方汉族AL病患者和803例中国北方汉族CML患者的HLA-A、B、DRB1表型数据,采用最大似然性方法分别计算两个群体的HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型频率,并采用(2检验方法比较其分布差异.结果 两个患者群体中,A位点的A*02、A*03、A*24,B位点的B*37、B*38、B*44、B*45、B*46、B*50、B*51、B*52、B*54、B*60、B*65,DR位点的DRB1*03、DRB1*09、DRB1*10、DRB1*15等位基因的分布有统计学差异.在两个患者群体中有326条A-B单倍型,357条B-DRB1单倍型,1 278条A-B-DRB1单倍型为共有单倍型,其中7.1%(23/326)A-B单倍型,6.2%(22/357)B-DRB1单倍型,4.0%(51/1278)条A-B-DRB1单倍型有统计学差异(x2>3.84,P<0.05).结论 中国北方汉族AL和CML两个患者群体的HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型均具有高度遗传多态性,并有其自身遗传特征.     

获得性类B的诊断和鉴定1例

人类ABO血型是由血型基因所决定的，是基因遗传的表达，终身不变，但在罕见情况下其血型表达会受到后天影响而有所改变，获得性类B抗原就是其中的一种情况。患没有B血型抗原的遗传基因，但却有B血型抗原的表达。获得性类B的形成与消化系统疾病如结肠癌、胃癌、直肠癌等革兰氏阴性细菌感染有关，多为A型患，这类患常引起ABO定型困难、配血失误，造成溶血性输血反应，甚至导致患死亡。有关获得性类B患的血型血清学具体的鉴定方法国内未见报道，现报道1例获得性类B患的诊断和血型血清学鉴定方法。     

深圳汉族人群HLA-Cw，-DQB1基因座等位基因的多态性

背景：HLA复合体是极其复杂的遗传系统，对其多态性的研究在法医学个体识别和亲权鉴定、群体遗传学、移植免疫、疾病相关等医学领域有重要的应用价值。 目的：了解HLA-Cw，-DQB1基因座的等位基因在深圳汉族人群中的分布规律。 设计、时间及地点：样本基因型的统计学分析，于2007-01/2008-06深圳市血液中心免疫遗传研究室完成。 材料：样本来自中国造血干细胞捐献者资料库深圳地区志愿捐献者，使用EDTA-K2抗凝管采集外周血。 方法：采用聚合酶链式反应-序列测定方法对深圳地区226名无关供者HLA-Cw，-DQB1基因座的2，3外显子进行序列测定与分析。等位基因频率采用直接计数法计算，Hardy-Weinberg平衡检验采用x2检验。 主要观察指标：样本HLA-Cw，-DQB1基因座的基因型。 结果：226个样本中共检测到25个Cw等位基因。其中Cw*0102，Cw*0702的频率最高（0.1881），其他频率较高的等位基因依次为Cw*0304，Cw*0302，Cw*0401及Cw*0801，Cw*0303，Cw*0602。该位点基因型观察值与期望值经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡定律（x2=116.00，u=1.78, ν=91，P > 0.05）。226个样本中共检测到17个DQB1等位基因。其中DQB1*0301占绝对优势，其基因频率为0.2124。其他频率较高的等位基因依次为DQB1*0303，DQB1*0601，DQB1*0502，DQB1*0602，DQB1*0302，DQB1*0401。该位点基因型观察值与期望值经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡定律（x2=101.34，u=0.78,ν=91，P > 0.05）。经计算HLA-Cw位点的杂合度为0.887 8，个体识别力为0.976 9，非父排除率为0.773 1，多态性信息含量为0.875 7；HLA-DQB1位点的杂合度为0.889 4，个体识别力为0.976 2，非父排除率为0.753 3，多态性信息含量为0.965 9。 结论：深圳汉族人群HLA-Cw及DQB1基因座是高度杂合、具有较高鉴别力和丰富信息含量的遗传标记，能较好地反映群体遗传特征。     

杂合性歧义引物分离法在解决人类白细胞抗原基因歧义分型结果中的应用

目的 评估杂合性歧义引物分离法(HARPs)在解决中国汉族人群人类白细胞抗原(HLA)基因歧义分型结果中的应用价值,并筛选合适的HARPs引物.方法 416名南方汉族个体的HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1基因通过PCR-测序分型(PCR-SBT)方法进行基因分型,并采用美国Atria公司的HARPs引物对其中的歧义分型标本进行附加测序分型.结果 86.3%(132/153)的HLA-A、73.9%(130/176)的HLA-B和38-1%(85/223)的HLA-DRB1歧义分型标本可以通过HARPs方法有效解决;其中48.5%(64/132)的HLA-A、80.0%(104/130)的HLA-B和100.0%(85/85)的HLA-DRB1歧义分型标本只需要1种HAPRs引物,47.7%(63/132)的HLA-A、20.0%(26/130)的HLA-B需要同时使用2种HAPRs引物;3～6种HARPs引物可以解决90%以上的歧义分型标本.结论 HARPs可作为解决中国汉族人群HIM-A、HLA-B、HLA-DRB1基因SBT歧义分型结果的常规方法.