人骨髓间质干细胞来源外体的分离鉴定及生物学特性

目的 分离纯化人骨髓间质干细胞（MSCs）来源的外体（exosome）,并鉴定其生物学特性。 方法 收集人骨髓MSCs培养上清,采用超滤及梯度离心法分离并纯化exosome,通过透射电镜观察其形态,SDS-PAGE电泳初步分析exosome蛋白质组成,western blot检测exosome包含的相关蛋白质,用流式细胞术检测其表面标志CD44、CD29等。 结果 骨髓来源的MSCs能够分泌exosome,电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构,直径约40~100 nm。exosome内含多种蛋白质成分,具有MSCs膜脂质成分,能与PKH26脂质染料结合,并表达MSCs表面黏附分子CD44、CD29。 结论 人骨髓MSCs能够分泌exosome,采用超滤及梯度离心法可以成功从MSCs培养上清中分离纯化exosome,MSCs分泌的exosome具有MSCs的胞膜及胞质蛋白组分。本研究可为进一步开展人骨髓MSCs来源exosome的生物学特性及其在组织损伤修复中的作用和机制研究提供实验基础。     

“纤维蛋白原-凝血酶”法建立人胃癌组织块裸鼠胃癌原位移植模型

目的：采用“纤维蛋白原-凝血酶”法建立人胃癌组织块裸鼠胃癌原位移植模型,为研究胃癌的发病机制及实验治疗提供理想的动物模型。方法：以人胃癌细胞株SGC-7901反复接种传代于BALB／C裸鼠皮下形成的皮下移植瘤组织块为材料,采用“纤维蛋白原-凝血酶”法将其粘贴于裸鼠胃壁,观察原位移植瘤的生长情况,移植成功率及转移情况。结果：“纤维蛋白原-凝血酶”法人胃癌组织块原位移植成功率为100％,局部淋巴结转移率为100％,肝脏及其他脏器转移发生率为83％,腹腔积液形成率为50％。结论：“纤维蛋白原-凝血酶”法能成功地建立人胃癌组织块裸鼠原位移植模型,并能很好地重现胃癌患者的临床转移过程,可为胃癌的临床研究提供一种简便、易行的实验模型。     

肿瘤干细胞标志物CD133检测在胃癌诊断中的意义

目的 检测胃癌组织和癌旁组织中肿瘤干细胞标志物CD133的表达,探讨其与临床病理参数的相关性和在肿瘤诊断中的意义。 方法 收集36例胃癌患者手术切除的癌组织和对应的癌旁组织,用RT-PCR检测CD133的mRNA表达,用免疫组织化学技术检测CD133蛋白质的表达,分析CD133 mRNA在胃癌组织中的表达与临床病理参数的相关性。 结果 CD133 mRNA表达阳性率为胃癌组织66.7%（24/36）,癌旁组织为16.7%（6/36）,差异有统计学意义（P＜0.01）;胃癌组织中CD133表达阳性率与肿瘤分化状态相关,低、未分化组高于中、高分化组（P＜0.01),但与年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、TNM分期和有无淋巴结转移无关。 结论 肿瘤干细胞标志物CD133的表达与胃癌的发生及分化状态相关,可作为胃癌诊断的一个新的分子标志物。     

hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建人重组肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因腺病毒载体(Ad-HGF),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),为转基因治疗提供实验基础.方法:设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物,PCR扩增hHGF,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上.重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,筛选获得含有hHGF的重组腺病毒质粒,PCR、酶切鉴定并测序.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,经3轮扩增,制备高效表达的AdGFP/HGF,并转染hucMSCs.结果:重组腺病毒质粒经PCR和SalⅠ,XbaⅠ酶切鉴定,证实含有HGF基因,测序结果和设计片段的序列一致.荧光显微镜下发现293A细胞发光率几乎为100%,感染的hucMSCs亦可表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建了hHGF腺病毒表达载体,并获得高滴度的病毒, 能高效感染hucMSCs,为后续研究奠定了基础.     

Tim4基因定量检测方法的建立及在消化道肿瘤中的初步应用

目的: 建立T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(T cells immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule 4,Tim4)基因表达的实时荧光定量PCR(实时RT-PCR)的检测方法,探讨Tim4基因在消化道肿瘤中的表达差异.方法: 构建包含Tim4基因片段的标准质粒,通过RT-PCR,实时RT-PCR等检测并比较Tim4基因在37例胃癌组织、19例结直肠癌组织与对应癌旁组织中的表达水平. 结果: 建立的Tim4基因定量检测方法准确可靠;在37例胃癌组织中,26例癌旁组织Tim4基因表达量高于对应癌组织(26/37),且在26例癌旁组织高表达的样本中,18例(69.2%)胃癌癌旁组织与癌组织表达比率大于2;在19例结直肠癌中12例癌旁组织表达高于对应的癌组织(12/19),其中癌旁组织高表达率(大于2)为 75.0%(9/12).结论: 成功建立了检测Tim4基因的实时RT-PCR方法,Tim4基因在结直肠癌和胃癌的癌组织中表达呈低趋势,这为深入探讨Tim4基因与肿瘤的关系提供了实验基础.     

Bim-1基因在胃癌中的表达及其临床意义

目的:探讨Bim-1基因在胃腺癌细胞株、胃癌组织和癌旁组织以及胃癌患者外周血中的表达水平及其与临床病理特征的关系.方法:收集80例胃癌患者的癌组织和癌旁组织,培养胃腺癌细胞株(SGC-7901,BGC-823,AGS),采用RT-PCR和实时PCR的方法检测Bmi-1基因的表达情况.另外同时收集Bim-1基因阳性胃癌患者外周血标本以及健康体检者外周血标本各20例,用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离获得单个核细胞,采用巢式PCR和实时PCR的方法检测其Bmi-1基因的表达情况.采用蛋白质印迹法验证胃癌组织和对应的癌旁组织以及胃癌患者及健康体检者血单个核细胞中Bim-1蛋白的表达情况. 结果:胃腺癌细胞株(SGC-7901,BGC-823,AGS)中Bim-1均高表达;胃癌组织中Bim-1表达(85%)明显高于癌旁组织(30%)(P<0.05);胃癌患者外周血单个核细胞Bim-1基因的阳性率为60%,显著高于健康体检者(P<0.05).胃癌组织和癌旁组织中Bim-1的蛋白水平存在差异,而在外周血中未见明显差异.结论:Bim-1基因在胃腺癌细胞株以及胃癌组织中高表达,胃癌患者外周血单个核细胞Bim-1的阳性率高于健康体检者,通过检测Bim-1基因可为胃癌的临床诊断及其靶向治疗提供新途径.